Reaaliaikaisen qPCR-menetelmän kehittäminen tuotekehityksen referenssimenetelmäksi patogeeniselle Yersinia enterocoliticalle
Nurmela, Taira (2016)
Nurmela, Taira
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201604154401
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201604154401
Tiivistelmä
Yersinia enterocolitca on jääkaappiolosuhteissa viihtyvä, elintarvikeperäisten gastroenteriittien kolmanneksi yleisin taudinaiheuttaja koko Euroopassa. Yersinioiden aiheuttaman, jopa kaksi viikkoa kestävän, yersinioosiksi kutsutun suolistoinfektion oireisiin kuuluvat kuume, kovat vatsakivut ja ripuli. Y.enterocolitica tunnistetaan kliinisistä ulostenäytteistä viljelemällä tai PCR-menetelmällä, mutta sen haastava viljeltävyys, apatogeenisten kantojen antamat väärät positiiviset viljetytulokset ja plasmidikato voivat johtaa virheelliseen diagnoosiin.
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää Orion Diagnostica Oy:n tuotekehitysosastolle uuden testimenetelmän kehittämisen avuksi referenssimenetelmä Y.enterocolitica baktee-rin tunnistamiseen. Tavoitteena oli saada kaupallisen referenssimenetelmän rinnalle kahdesta kolmeen eri virulenssigeeneille suunniteltua PCR-menetelmää, joilla patogeeniset kannat voitaisiin tunnistaa spesifisesti.
Työtä varten tehtiin kirjallisuuskatsaus, jonka pohjalta lähdettiin testaamaan useita valmiita Yersinioille suunniteltuja PCR-menetelmiä. Kun tarpeeksi spesifiseen ja herkkään tulokseen ei näillä menetelmillä päästy, alettiin tarvetta vastaavaa menetelmää suunnittelemaan itse.
Reaaliaikaisen qPCR-referenssimenetelmän kehittäminen aloitettiin suunnittelemalla alukkeet patogeenisille Y.enterocolitica-bakteerikannoille spesifiselle ail-geenialueelle. Suunniteltuja alukkeita testattiin ja sopivimmat valittiin mukaan menetelmän optimointiin. Optimoidulle menetelmälle tehtiin kantakattavuus- ja ristireaktiotestit, joissa pyrittiin viitteellisesti arvioimaan testin spesifisyyttä ja herkkyyttä. Lopuksi menetelmää testattiin vielä kliinisillä uloste-näytteillä.
Opinnäytetyön kokeellisen osuuden aikana onnistuttiin kehittämään patogeenisten Y.enterocolitica-kantojen tunnistamiseen sopiva herkkä, reaaliaikainen qPCR-menetelmä. Koska käytössä ei ollut yhtään Yersinia-positiiviseksi todettua kliinistä ulostenäytettä, ei menetelmän toimivuutta kliinisten näytteiden osalta voitu varmistaa. Kliinisiä ulostenäytteitä testattaessa kahdeksan näytteen kohdalla kuitenkin ilmeni epäspesifistä monistumista, minkä osalta selvitystyötä on vielä jatkettava. Näytteenottomuodon havaittiin saattavan vaikuttaa sekä kehitetyllä menetelmällä saataviin tuloksiin että referenssimenetelmän kehityksessä käytetyn kaupallisen referenssimenetelmän antamiin tuloksiin.
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää Orion Diagnostica Oy:n tuotekehitysosastolle uuden testimenetelmän kehittämisen avuksi referenssimenetelmä Y.enterocolitica baktee-rin tunnistamiseen. Tavoitteena oli saada kaupallisen referenssimenetelmän rinnalle kahdesta kolmeen eri virulenssigeeneille suunniteltua PCR-menetelmää, joilla patogeeniset kannat voitaisiin tunnistaa spesifisesti.
Työtä varten tehtiin kirjallisuuskatsaus, jonka pohjalta lähdettiin testaamaan useita valmiita Yersinioille suunniteltuja PCR-menetelmiä. Kun tarpeeksi spesifiseen ja herkkään tulokseen ei näillä menetelmillä päästy, alettiin tarvetta vastaavaa menetelmää suunnittelemaan itse.
Reaaliaikaisen qPCR-referenssimenetelmän kehittäminen aloitettiin suunnittelemalla alukkeet patogeenisille Y.enterocolitica-bakteerikannoille spesifiselle ail-geenialueelle. Suunniteltuja alukkeita testattiin ja sopivimmat valittiin mukaan menetelmän optimointiin. Optimoidulle menetelmälle tehtiin kantakattavuus- ja ristireaktiotestit, joissa pyrittiin viitteellisesti arvioimaan testin spesifisyyttä ja herkkyyttä. Lopuksi menetelmää testattiin vielä kliinisillä uloste-näytteillä.
Opinnäytetyön kokeellisen osuuden aikana onnistuttiin kehittämään patogeenisten Y.enterocolitica-kantojen tunnistamiseen sopiva herkkä, reaaliaikainen qPCR-menetelmä. Koska käytössä ei ollut yhtään Yersinia-positiiviseksi todettua kliinistä ulostenäytettä, ei menetelmän toimivuutta kliinisten näytteiden osalta voitu varmistaa. Kliinisiä ulostenäytteitä testattaessa kahdeksan näytteen kohdalla kuitenkin ilmeni epäspesifistä monistumista, minkä osalta selvitystyötä on vielä jatkettava. Näytteenottomuodon havaittiin saattavan vaikuttaa sekä kehitetyllä menetelmällä saataviin tuloksiin että referenssimenetelmän kehityksessä käytetyn kaupallisen referenssimenetelmän antamiin tuloksiin.