Tripeptidin IPP:n kvantitointimenetelmän kehitys eri HPLC-kolonneilla sekä yhdisteen varmistus MALDI:lla ja ESI/MS:llä
Sundqvist, Susann (2016)
Sundqvist, Susann
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605198696
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605198696
Tiivistelmä
Työ suoritettiin Helsingin yliopiston Medicumin Lääketieteellisillä laitoksilla, Kliinisen Proteomiikan yksikössä, Helsinki, Suomi. Tripeptidi isoleusyyliprolyyliproliini (IPP) määritys kuuluu Farmakologian yksikön tutkimuksiin, jossa pyritään löytämään terveyteen suotuisasti vaikuttavia ruoka-aineita. Tripeptidi on pooliton ja hyvin hydrofobinen joka tekee sen ongelmallinen erotettavaksi kromatografian keinoin (peptidin heikon interaktion kolonnin matriisin kanssa).
Työn tarkoituksena oli löytää sopiva protokolla IPP:n kromatografiseen analyysiin. Käytännössä kokeiltiin useita eri kolonneja joita kokeiltiin eri kromatografisissa olosuhteissa. Kokeet suoritettiin kahdella eri kromatografialaitteella SMART (entinen Pharmacia) ja ÄKTA flpc (GE Healthcare Life Sciences). MALDI-TOF:lla ja sähkösumutusionisaatiomassaspektrometreillä (Bruker Daltonics) varmennettiin tripeptidi.
Työssä käytettiin kahta päätyyppiä olevia kolonneja, nimittäin käänteisfaasikromatografiassa (RPC) end capping muokatuilla oktadekyylisilanolikolonneja (C18) ja paljas silikapartikkeli kolonneja HILIC:ssä. Käytetyt puskurit olivat asetonitriilipohjaisia. Puskurin pH säätöön käytettiin trifluorietikkahappoa (TFA, 0,1 %), 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) tai 10 mM ammoniumformaattia (pH 4,5) jota käytettiin HILIC kromatografiaan. Kolonneista oli kolme ODS- ja kolme HILIC -kolonneja
Paras erotus saatiin yhdistelmällä Watersin X Bridge -kolonnilla (C18) 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) ja SMART -laitteistolla. Peptidi eluoitui kapeana vyöhykkeenä virtauksen ollessa 0,1 ml/min isokraattisella gradientilla. Watersin HILIC SILICA -kolonni ja 10 mM ammoniumformaatti puskurin (pH 4,5) tulokset vaikuttivat lupaavilta ja saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa.
Valittiin IPP tripeptidin erottumiseen ja kvantitointiin kaksi RP C18 -kolonnia (Watersin X Bridge ja Kinetexin EVO) käytettäväksi joko happamalla tai emäksisellä puskurilla. Näillä olosuhteilla voitiin luotettavasti erottaa ja kvantitoida 0,1 µg synteettistä peptidiä. Samankaltaisia tuloksia saatiin IPP:n rotan suolen läpäisevyyspilottitutkimuksessa (yhteistyössä Prof. Riitta Korpelan ryhmän kanssa, Farmakologian osastolta).
Työn tarkoituksena oli löytää sopiva protokolla IPP:n kromatografiseen analyysiin. Käytännössä kokeiltiin useita eri kolonneja joita kokeiltiin eri kromatografisissa olosuhteissa. Kokeet suoritettiin kahdella eri kromatografialaitteella SMART (entinen Pharmacia) ja ÄKTA flpc (GE Healthcare Life Sciences). MALDI-TOF:lla ja sähkösumutusionisaatiomassaspektrometreillä (Bruker Daltonics) varmennettiin tripeptidi.
Työssä käytettiin kahta päätyyppiä olevia kolonneja, nimittäin käänteisfaasikromatografiassa (RPC) end capping muokatuilla oktadekyylisilanolikolonneja (C18) ja paljas silikapartikkeli kolonneja HILIC:ssä. Käytetyt puskurit olivat asetonitriilipohjaisia. Puskurin pH säätöön käytettiin trifluorietikkahappoa (TFA, 0,1 %), 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) tai 10 mM ammoniumformaattia (pH 4,5) jota käytettiin HILIC kromatografiaan. Kolonneista oli kolme ODS- ja kolme HILIC -kolonneja
Paras erotus saatiin yhdistelmällä Watersin X Bridge -kolonnilla (C18) 20 mM ammoniumformaattia (pH 10) ja SMART -laitteistolla. Peptidi eluoitui kapeana vyöhykkeenä virtauksen ollessa 0,1 ml/min isokraattisella gradientilla. Watersin HILIC SILICA -kolonni ja 10 mM ammoniumformaatti puskurin (pH 4,5) tulokset vaikuttivat lupaavilta ja saatuja tuloksia voidaan hyödyntää tulevissa tutkimuksissa.
Valittiin IPP tripeptidin erottumiseen ja kvantitointiin kaksi RP C18 -kolonnia (Watersin X Bridge ja Kinetexin EVO) käytettäväksi joko happamalla tai emäksisellä puskurilla. Näillä olosuhteilla voitiin luotettavasti erottaa ja kvantitoida 0,1 µg synteettistä peptidiä. Samankaltaisia tuloksia saatiin IPP:n rotan suolen läpäisevyyspilottitutkimuksessa (yhteistyössä Prof. Riitta Korpelan ryhmän kanssa, Farmakologian osastolta).