LACTOBACILLUS SOBRIUS -KANNAN PINTAKERROSPROTEIINIGEENIN KLOONAUS, ILMENTÄMINEN JA PROTEIININ KIINNITTYMISOMINAISUUDET
Fortelius, Anne (2008)
Fortelius, Anne
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2008
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812024186
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-200812024186
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan perus-eläinlääketieteen laitoksella.
Lactobacillus sobrius -lajilla on todettu olevan probioottisia vaikutuksia porsailla, ja sillä on havaittu adheesiota suolen limakalvoille ja epiteelisoluihin toistaiseksi tuntemattomalla mekanismilla. Tutkimuksen kohteena on pintakerrosproteiinin mahdollisesti aiheuttama adheesio ja pintakerrosproteiinin mahdolliset sovellukset antigeenien kuljettajana.
Tämän työn tarkoituksena oli kloonata L. sobrius GRL1110 -kannan pintakerrosproteiinia (Slp, Surface Layer Protein) koodaava geeni, tuottaa pintakerrosproteiinia Esherichia coli -bakteerissa ja tehdä alustavia adheesiokokeita sian suolen epiteelisolujen (IPEC-1) kans-sa.
L. sobrius -solujen pinnalta uutettiin proteiinit, joista oikean kokoinen valittiin N-terminaaliseen aminohapposekvensointiin. Sekvenssin perusteella tehtiin alukkeet, joilla saatiin PCR:llä monistettua slp1-geeni. Geeni ligatoitiin pET-28b(+)-vektoriin ja elektro-kompetentit E. coli -solut transformoitiin. Rekombinanttiproteiinia tuotettiin E. coli
-ekspressiosoluissa, ja saatu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografialla. L. sobrius
-kannasta eristettiin soluseinät. Pintakerrosproteiinin sitoutumista testattiin soluseiniin, ja kokonaisten L. sobrius -solujen ja soluseinien sitoutumista testattiin sian suolen epitee-lisolulinjaan (IPEC-1).
L. sobrius -soluja sitoutui IPEC-1 -soluihin suunnilleen yhtä paljon riippumatta siitä, oliko niistä uutettu pintakerrosproteiinit guanidiinihydrokloridilla vai ei. Tämä viittaisi siihen, että jos pintakerrosproteiini aiheuttaakin adheesiota epiteelisoluihin, niin myös jokin toinen komponentti L. sobrius -soluissa aiheuttaa sitä. Eristetyt soluseinät eivät kuitenkaan sitou-tuneet epiteelisoluihin sellaisenaan, ja jatkossa lähdetään tutkimaan, sitoutuvatko pinta-proteiinikerroksella peitetyt soluseinäfragmentit IPEC-1-soluihin.
Lactobacillus sobrius -lajilla on todettu olevan probioottisia vaikutuksia porsailla, ja sillä on havaittu adheesiota suolen limakalvoille ja epiteelisoluihin toistaiseksi tuntemattomalla mekanismilla. Tutkimuksen kohteena on pintakerrosproteiinin mahdollisesti aiheuttama adheesio ja pintakerrosproteiinin mahdolliset sovellukset antigeenien kuljettajana.
Tämän työn tarkoituksena oli kloonata L. sobrius GRL1110 -kannan pintakerrosproteiinia (Slp, Surface Layer Protein) koodaava geeni, tuottaa pintakerrosproteiinia Esherichia coli -bakteerissa ja tehdä alustavia adheesiokokeita sian suolen epiteelisolujen (IPEC-1) kans-sa.
L. sobrius -solujen pinnalta uutettiin proteiinit, joista oikean kokoinen valittiin N-terminaaliseen aminohapposekvensointiin. Sekvenssin perusteella tehtiin alukkeet, joilla saatiin PCR:llä monistettua slp1-geeni. Geeni ligatoitiin pET-28b(+)-vektoriin ja elektro-kompetentit E. coli -solut transformoitiin. Rekombinanttiproteiinia tuotettiin E. coli
-ekspressiosoluissa, ja saatu proteiini puhdistettiin affiniteettikromatografialla. L. sobrius
-kannasta eristettiin soluseinät. Pintakerrosproteiinin sitoutumista testattiin soluseiniin, ja kokonaisten L. sobrius -solujen ja soluseinien sitoutumista testattiin sian suolen epitee-lisolulinjaan (IPEC-1).
L. sobrius -soluja sitoutui IPEC-1 -soluihin suunnilleen yhtä paljon riippumatta siitä, oliko niistä uutettu pintakerrosproteiinit guanidiinihydrokloridilla vai ei. Tämä viittaisi siihen, että jos pintakerrosproteiini aiheuttaakin adheesiota epiteelisoluihin, niin myös jokin toinen komponentti L. sobrius -soluissa aiheuttaa sitä. Eristetyt soluseinät eivät kuitenkaan sitou-tuneet epiteelisoluihin sellaisenaan, ja jatkossa lähdetään tutkimaan, sitoutuvatko pinta-proteiinikerroksella peitetyt soluseinäfragmentit IPEC-1-soluihin.