Rapid detection of Streptococcus agalactiae using Strand Invasion Based Amplification (SIBA®) Method
Hirvonen, Sanna (2017)
Hirvonen, Sanna
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017060111803
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017060111803
Tiivistelmä
Tämän insinöörityön tavoitteena oli kehittää uusi ja nopea tapa Streptococcus agalacitaen tunnistamiseksi isotermaalista SIBA®- teknologiaa hyödyntäen. S.agalactiae eli B-ryhmän streptokokki (GBS) on beetahemolyytinen bakteeri, joka on merkittävä vastasyntyneiden infektioiden aiheuttaja. Lisäksi se voi aiheuttaa infektioita raskaana oleville naisille, vanhuksille sekä henkilöille, joilla on jokin perussairaus.
Tämän insinöörityön kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa. Työ aloitettiin oligoseulonnalla sopivan alukeparin löytämiseksi. Seulonnan ohella S.agalactiaea kasvatettiin verimaljalla ja LB-liemessä sekä pystytettiin kirjallisuuteen perustuva qPCR-menetelmä GBS:n tunnistamiseksi. LB-liemestä eristettiin genomista DNA:ta, joka kvantitoitiin qPCR:n avulla. Seulonnasta läpi päässeet alukeparit testattiin genomisella DNA:lla, ja jatkoon päässeet menetelmät optimoitiin. Optimoitujen menetelmien herkkyys ja spesifisyys testattiin sekä toimiva menetelmä kylmäkuivattiin. Lisäksi testattiin erilaisten lyysaysentsyymien vaikutusta SIBA®-reaktioon sekä entsyymien lyysaystehoa GBS-soluihin. Lopuksi menetelmää testattiin kliinisillä näytteillä kylmäkuivattuja reagensseja käyttäen.
Insinöörityön aikana onnistuttiin kehittämään nopea menetelmä S.agalactiaen tunnistamiseksi. Kylmäkuivatuilla reagensseilla menetelmä tunnisti GBS:n nopeimmillaan 5,7 minuutissa, kun templaattina käytettiin genomista DNA:ta. Kliiniset näytteet testattiin sekä qPCR:llä että kylmäkuivatuilla SIBA®-reagensseilla, ja molemmissa testeissä positiivisista näytteistä 1/3 detektoitui. Näytteet, jotka eivät detektoituneet, saattoivat olla heikkoja positiivisia tai käytetty näytteenkäsittelymenetelmä ei soveltunut testiasetelmaan.
Insinöörityön tulosten pohjalta menetelmän kehittämistä voi jatkaa kylmäkuivatun SIBA®-reaktion olosuhteiden optimoinnilla. Lisäksi näytteenkäsittelymenetelmiä tulee kehittää. Myös qPCR-menetelmän herkkyyden testaus ja mahdollinen optimointi olisi hyvä tehdä, sillä niitä ei ehditty tämän insinöörityön aikana suorittaa.
Tämän insinöörityön kokeellinen osuus suoritettiin Orion Diagnostica Oy:n tuotekehityslaboratoriossa. Työ aloitettiin oligoseulonnalla sopivan alukeparin löytämiseksi. Seulonnan ohella S.agalactiaea kasvatettiin verimaljalla ja LB-liemessä sekä pystytettiin kirjallisuuteen perustuva qPCR-menetelmä GBS:n tunnistamiseksi. LB-liemestä eristettiin genomista DNA:ta, joka kvantitoitiin qPCR:n avulla. Seulonnasta läpi päässeet alukeparit testattiin genomisella DNA:lla, ja jatkoon päässeet menetelmät optimoitiin. Optimoitujen menetelmien herkkyys ja spesifisyys testattiin sekä toimiva menetelmä kylmäkuivattiin. Lisäksi testattiin erilaisten lyysaysentsyymien vaikutusta SIBA®-reaktioon sekä entsyymien lyysaystehoa GBS-soluihin. Lopuksi menetelmää testattiin kliinisillä näytteillä kylmäkuivattuja reagensseja käyttäen.
Insinöörityön aikana onnistuttiin kehittämään nopea menetelmä S.agalactiaen tunnistamiseksi. Kylmäkuivatuilla reagensseilla menetelmä tunnisti GBS:n nopeimmillaan 5,7 minuutissa, kun templaattina käytettiin genomista DNA:ta. Kliiniset näytteet testattiin sekä qPCR:llä että kylmäkuivatuilla SIBA®-reagensseilla, ja molemmissa testeissä positiivisista näytteistä 1/3 detektoitui. Näytteet, jotka eivät detektoituneet, saattoivat olla heikkoja positiivisia tai käytetty näytteenkäsittelymenetelmä ei soveltunut testiasetelmaan.
Insinöörityön tulosten pohjalta menetelmän kehittämistä voi jatkaa kylmäkuivatun SIBA®-reaktion olosuhteiden optimoinnilla. Lisäksi näytteenkäsittelymenetelmiä tulee kehittää. Myös qPCR-menetelmän herkkyyden testaus ja mahdollinen optimointi olisi hyvä tehdä, sillä niitä ei ehditty tämän insinöörityön aikana suorittaa.