Expression, Purification and Characterization of Complement Factor H and Apolipoprotein E
Gromyko, Mikhail (2018)
Gromyko, Mikhail
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018053111763
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018053111763
Tiivistelmä
Komplementtisysteemi on humoraalisen synnynnäisen immuunivasteen keskeinen toimija. Se hyökkää välittömästi niitä mikrobeja ja vieraita aineita vastaan, jotka tunkeutuvat elimistöön. Se toimii plasmassa jatkuvasti, ja sitä voidaan aktivoida helposti itsepinnoilla ja siten se laukaisee paikallisen tulehduksen, jos tehokkaat säätävyysmekanismit puuttuvat. Komplementtifaktori H (CFH) on yksi tärkeimmistä komplementtisäätelytekijöistä plasmassa, ja sen on viime aikoina osoitettu olevan vuorovaikutuksessa apolipoproteiini E:n kanssa, joka on useimmiten lipidien metaboliaan liittyvä multifunktionaalinen proteiini, prosessissa, joka vähentää komplementin aktivoitumista plasmassa.
Tämä tutkimus aloitettiin, koska haluttiin tutkia sitoutumismekanismia komplementtifaktori H:n (CFH) ja apolipoproteiini E:n (apoE) välillä. Tutkimuksia suoritettiin Helsingin yliopiston Bakteriologian ja Immunologian tutkimusohjelmayksikössä. Laboratoriotyö tehtiin Jokiranta-ryhmän tutkimuksen osana.
Opinnäytetyön tavoitteena oli ilmentää komplementtifaktori H:n 5–7 domeenia, saada CFH 5–7:n korkeailmentävä Pichia pastoris -klooni ja eristää apoE:ta ihmisen hyvin alhaisen tiheyden lipoproteiinin (VLDL) ja välituotetta lipoproteiinin (IDL) partikkeleista. Näitä eristettyjä molekyylejä käytetään tutkimuksessa, jossa selvitetään CFH:n ja apoE:n roolia ateroskleroosin alkuvaiheessa komplementtivälitteisen tulehduksen vähentämisessä.
Tässä työssä on kuvattu CFH:n 3-domeenin fragmentin (CFH 5–7) kloonaus, tuotanto ja puhdistus ja apoE:n eristäminen ihmisen VLDL- ja IDL-partikkeleista. CFH 5–7:n ilmentymisen menetelmä suoritettiin onnistuneesti. Tätä varten maksimimäärä puhtainta proteiinia ilmennettiin. CFH 5–7:n kokonaismäärä (~400 µg) oli riittävä lisäkokeille. Lisää plasmidimuunnosmenettelyn optimointia tarvitaan, jotta saataisiin korkeaa määrää ilmentävä CFH 5-7 Pichia Pastoris -klooni tulevaisuudessa.
Tämä tutkimus aloitettiin, koska haluttiin tutkia sitoutumismekanismia komplementtifaktori H:n (CFH) ja apolipoproteiini E:n (apoE) välillä. Tutkimuksia suoritettiin Helsingin yliopiston Bakteriologian ja Immunologian tutkimusohjelmayksikössä. Laboratoriotyö tehtiin Jokiranta-ryhmän tutkimuksen osana.
Opinnäytetyön tavoitteena oli ilmentää komplementtifaktori H:n 5–7 domeenia, saada CFH 5–7:n korkeailmentävä Pichia pastoris -klooni ja eristää apoE:ta ihmisen hyvin alhaisen tiheyden lipoproteiinin (VLDL) ja välituotetta lipoproteiinin (IDL) partikkeleista. Näitä eristettyjä molekyylejä käytetään tutkimuksessa, jossa selvitetään CFH:n ja apoE:n roolia ateroskleroosin alkuvaiheessa komplementtivälitteisen tulehduksen vähentämisessä.
Tässä työssä on kuvattu CFH:n 3-domeenin fragmentin (CFH 5–7) kloonaus, tuotanto ja puhdistus ja apoE:n eristäminen ihmisen VLDL- ja IDL-partikkeleista. CFH 5–7:n ilmentymisen menetelmä suoritettiin onnistuneesti. Tätä varten maksimimäärä puhtainta proteiinia ilmennettiin. CFH 5–7:n kokonaismäärä (~400 µg) oli riittävä lisäkokeille. Lisää plasmidimuunnosmenettelyn optimointia tarvitaan, jotta saataisiin korkeaa määrää ilmentävä CFH 5-7 Pichia Pastoris -klooni tulevaisuudessa.