Apoptoosin detektointi diabeettisen hiirimallin munuaisleikkeistä
Keski-Mattinen, Kirsi (2010)
Keski-Mattinen, Kirsi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112515690
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112515690
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Sanna Lehtosen tutkimusryhmässä Helsingin yliopiston Haartman-instituutin patologian osastolla. Tavoitteena oli löytää ja optimoida apoptoosin detektointimenetelmä hiiren munuaisleikkeille.
Munuaisleikkeet olivat peräisin diabeettisesta E1-DN-hiirimallista ja sen verrokkiryhmästä. E1-DN-hiiret sopivat erittäin hyvin hyperglykemian pitkäaikaisvaikutusten, kuten diabeettisen nefropatian, tutkimiseen. Diabeettinen nefropatian ensiasteessa valkuaisia vuotaa virtsaan ja tauti voi lopulta johtaa munuaisten vajaatoimintaan. Komplikaation histopatologiset muutokset, joissa lisääntyneellä apoptoosilla on oma roolinsa, tapahtuvat pääosin munuaiskeräsessä.
Apoptoosin kvantitatiivinen detektointi on erittäin hankalaa prosessin nopeuden takia. Solu käy apoptoosin läpi parissa tunnissa häviten lopulta jälkiä jättämättä. Apoptoosi on geneettisesti ohjelmoitu solukuolema, joka pystytään tunnistamaan sen morfologisista erikoispiirteistä, DNA:n pilkkoutumisesta ja spesifisten apoptoosia säätelevien proteiinien ilmentymisestä. Tässä opinnäytetyössä apoptoottisten solujen detektointiin käytettiin TUNEL-tekniikkaa ja apoptoosiin liittyvän kaspaasi-3-proteiinin immunohistokemiallista värjäystä.
TUNEL-tekniikan validoinnissa käytiin läpi useita menetelmän modifikaatioita huonon signaalin, taustavärjäytymisen ja tulosten vaihtelevuuden takia. Menetelmän optimointi tapahtui pääosin permeabilisoinnissa proteaasi- ja lämpökäsittelyä käyttäen. Muutokset eivät ratkaisseet ongelmia, ja kokeiltavaksi otettiin toinen apoptoosin detektointitapa, kaspaasi-3-proteaasin havainnointi immunohistokemiallisilla menetelmillä. Menetelmässä testattiin immunofluoresenssi ja -peroksidaasileimausta, joista immunoperoksidaasivärjäykset antoivat parhaimmat ja toistettavimmat tulokset. Optimoitua immunoperoksidaasivärjäystä päädyttiin käyttämään diabeettisten hiirien ja niiden verrokkiryhmän apoptoosin analysoinnissa. Tulosten mukaan diabeettisten E1-DN-hiirten glomeruluksissa on keskimäärin enemmän apoptoosia kuin verrokeissa. Tämän tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että korkealla verensokerilla on yhteys glomerulussolujen apoptoosin määrän kanssa.
Munuaisleikkeet olivat peräisin diabeettisesta E1-DN-hiirimallista ja sen verrokkiryhmästä. E1-DN-hiiret sopivat erittäin hyvin hyperglykemian pitkäaikaisvaikutusten, kuten diabeettisen nefropatian, tutkimiseen. Diabeettinen nefropatian ensiasteessa valkuaisia vuotaa virtsaan ja tauti voi lopulta johtaa munuaisten vajaatoimintaan. Komplikaation histopatologiset muutokset, joissa lisääntyneellä apoptoosilla on oma roolinsa, tapahtuvat pääosin munuaiskeräsessä.
Apoptoosin kvantitatiivinen detektointi on erittäin hankalaa prosessin nopeuden takia. Solu käy apoptoosin läpi parissa tunnissa häviten lopulta jälkiä jättämättä. Apoptoosi on geneettisesti ohjelmoitu solukuolema, joka pystytään tunnistamaan sen morfologisista erikoispiirteistä, DNA:n pilkkoutumisesta ja spesifisten apoptoosia säätelevien proteiinien ilmentymisestä. Tässä opinnäytetyössä apoptoottisten solujen detektointiin käytettiin TUNEL-tekniikkaa ja apoptoosiin liittyvän kaspaasi-3-proteiinin immunohistokemiallista värjäystä.
TUNEL-tekniikan validoinnissa käytiin läpi useita menetelmän modifikaatioita huonon signaalin, taustavärjäytymisen ja tulosten vaihtelevuuden takia. Menetelmän optimointi tapahtui pääosin permeabilisoinnissa proteaasi- ja lämpökäsittelyä käyttäen. Muutokset eivät ratkaisseet ongelmia, ja kokeiltavaksi otettiin toinen apoptoosin detektointitapa, kaspaasi-3-proteaasin havainnointi immunohistokemiallisilla menetelmillä. Menetelmässä testattiin immunofluoresenssi ja -peroksidaasileimausta, joista immunoperoksidaasivärjäykset antoivat parhaimmat ja toistettavimmat tulokset. Optimoitua immunoperoksidaasivärjäystä päädyttiin käyttämään diabeettisten hiirien ja niiden verrokkiryhmän apoptoosin analysoinnissa. Tulosten mukaan diabeettisten E1-DN-hiirten glomeruluksissa on keskimäärin enemmän apoptoosia kuin verrokeissa. Tämän tutkimuksen perusteella voidaan todeta, että korkealla verensokerilla on yhteys glomerulussolujen apoptoosin määrän kanssa.