DNA-koettimien testaus ympäristösirua varten
Avelin, Venla (2010)
Avelin, Venla
Lahden ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010122118802
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010122118802
Tiivistelmä
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli testata 87 aiemmin suunnitellun DNA-koettimen toimivuus LDR (Ligation Detection Reaction) -sirulla. Koettimet oli suunnitellut Atte Halttunen järvisedimentin mikrobistolle. Opinnäytetyö oli osa Euroopan aluekehitysrahaston YMLI-hanketta (A30175), jonka yhtenä tavoitteena on kehittää nopeita analyysimenetelmiä ympäristön mikrobien tutkimiseen.
Koettimien toimivuus ja spesifisyys testattiin synteettisillä DNA-templaateilla. Tutkimuksessa käytettiin Biotekniikan Instituutissa (Helsingin yliopisto) sovellet-tua LDR-sirutekniikkaa, jossa DNA-koettimesta muodostuu sirkulaarinen sen yhdistyessä kohde-DNA:n kanssa. Sirkulaarisuutta käytetään hyödyksi monista-malla koetinta polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla, jolloin tekniikan herkkyys paranee. PCR-tuotteen tuloksia tarkasteltiin agaroosigeelielektroforeesilla ja hyb-ridisaatiolla LDR-sirulle.
Opinnäytetyössä testatuista koettimista arvioitiin erinomaisiksi 38 %, hyviksi 22 %, heikoiksi 18 %, epäspesifeiksi 8 % ja toimimattomiksi 14 %. Arviointi perustui koettimien antaman signaalin vahvuuteen ja spesifisyyteen LDR-sirulla. Kun koettimien suunnittelijan arviot koettimien hyvyydestä otettiin myös huomioon, saatiin erinoimaisesti toimivia koettimia 19 ja hyviä 29.
Testauksessa olosuhteiden optimointi oli työlästä ja muutamilla koettimilla toiste-tut rinnkkaistestit antoivat ristiriitaisia tuloksia. Toimivia koettimia saatiin huo-mattavasti vähemmän, kuin muiden samantyyppisten tutkimusten tulosten perus-teella olisi voitu ennakoida. Lisäksi koettimien spesifisyydessä olisi ollut paran-tamisen varaa, sillä seitsemän koetinta todettiin ”häiriköiksi”, jotka reagoivat vä-hintään kymmenen eri templaatin kanssa.
Tulevissa DNA-koetintestauksissa kannattaa käyttää jotakin kontrollikoetinta ja olosuhdetesteissä siruhybridisaatioita ja agaroosigeelielektroforeesia rinnakkain. Tässä työssä saatiin aikaiseksi yhdessä aiemman suunnittelutyön kanssa 48 käyt-tökelpoista koetinta ja kehitettyä ympäristösirua eteenpäin, vaikka työtä riittääkin vielä ennen kuin kaupallinen tuote on valmis.
Koettimien toimivuus ja spesifisyys testattiin synteettisillä DNA-templaateilla. Tutkimuksessa käytettiin Biotekniikan Instituutissa (Helsingin yliopisto) sovellet-tua LDR-sirutekniikkaa, jossa DNA-koettimesta muodostuu sirkulaarinen sen yhdistyessä kohde-DNA:n kanssa. Sirkulaarisuutta käytetään hyödyksi monista-malla koetinta polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla, jolloin tekniikan herkkyys paranee. PCR-tuotteen tuloksia tarkasteltiin agaroosigeelielektroforeesilla ja hyb-ridisaatiolla LDR-sirulle.
Opinnäytetyössä testatuista koettimista arvioitiin erinomaisiksi 38 %, hyviksi 22 %, heikoiksi 18 %, epäspesifeiksi 8 % ja toimimattomiksi 14 %. Arviointi perustui koettimien antaman signaalin vahvuuteen ja spesifisyyteen LDR-sirulla. Kun koettimien suunnittelijan arviot koettimien hyvyydestä otettiin myös huomioon, saatiin erinoimaisesti toimivia koettimia 19 ja hyviä 29.
Testauksessa olosuhteiden optimointi oli työlästä ja muutamilla koettimilla toiste-tut rinnkkaistestit antoivat ristiriitaisia tuloksia. Toimivia koettimia saatiin huo-mattavasti vähemmän, kuin muiden samantyyppisten tutkimusten tulosten perus-teella olisi voitu ennakoida. Lisäksi koettimien spesifisyydessä olisi ollut paran-tamisen varaa, sillä seitsemän koetinta todettiin ”häiriköiksi”, jotka reagoivat vä-hintään kymmenen eri templaatin kanssa.
Tulevissa DNA-koetintestauksissa kannattaa käyttää jotakin kontrollikoetinta ja olosuhdetesteissä siruhybridisaatioita ja agaroosigeelielektroforeesia rinnakkain. Tässä työssä saatiin aikaiseksi yhdessä aiemman suunnittelutyön kanssa 48 käyt-tökelpoista koetinta ja kehitettyä ympäristösirua eteenpäin, vaikka työtä riittääkin vielä ennen kuin kaupallinen tuote on valmis.