Aminotransaminaasi-entsyymin puhdistus ja kiteytys
Sipola, Saara (2011)
Sipola, Saara
Oulun seudun ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096959
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201105096959
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tarkoituksena oli puhdistaa ja kiteyttää Escherichia coli BL21(DE3) -bakteeriin liitetyn Arthobacter citreus -bakteerin plasmidi-DNA:n tuottamaa aminotransaminaasi-entsyymiä (AcATA). Puhdistus tehtiin kolme kertaa ja menetelmä oli jokaisella kerralla samanlainen. Puhdistuksissa käytettiin EnBase® Flo -menetelmällä kasvatettuja soluja sekä ZYM505-mediumilla kasvatettuja soluja. Kiteytyskokeissa käytettiin molemmilla tavoilla kasvatettua ja puhdistettua AcATA-proteiinia. Lopuksi vertailtiin kaikkien puhdistusten tuloksia keskenään.
Puhdistus aloitettiin solujen hajotuksella ja ammoniumsulfaattisaostuksella, minkä jälkeen työssä siirryttiin anioninvaihtokromatografiaan. Ensimmäiseksi käytettiin HiTrap Capto DEAE -pylvästä, minkä jälkeen siirryttiin paremmin erot-televaan HiTrap Q HP -pylvääseen. Viimeisenä puhdistusvaiheena oli HiLoad Superdex 200 pg -geelisuodatuspylväs. AcATAn puhdistumista seurattiin proteiinipitoisuus- ja entsyymiaktiivisuusmittauksilla sekä SDS-PAGEn avulla.
AcATAn kiteytymiskokeissa optimoitiin olosuhteita proteiinikiteiden muodostu-miselle. Saatujen proteiinikiteiden laatua testattiin röntgendiffraktiolla (XRD). Työn aikana saatiin selville, että eri kasvatusmenetelmillä ei ollut proteiinin tuo-ton ja aktiivisuuden suhteen merkittävää eroa. Proteiinin molekyylipaino määri-tettiin, ja sen havaittiin olevan tetrameeri. XRD-kokeissa saatiin röntgendiffrak-tiokuva, joka oli hyvä alku AcATAn rakenteen selvittämiseksi. Myöhemmin Biokemian laitoksella ja Ranskassa testatuista kiteistä saatiin hyvää diffraktiotietoa, jonka avulla AcATAn rakennetta pystytään tulevaisuudessa selvittämään.
Puhdistus aloitettiin solujen hajotuksella ja ammoniumsulfaattisaostuksella, minkä jälkeen työssä siirryttiin anioninvaihtokromatografiaan. Ensimmäiseksi käytettiin HiTrap Capto DEAE -pylvästä, minkä jälkeen siirryttiin paremmin erot-televaan HiTrap Q HP -pylvääseen. Viimeisenä puhdistusvaiheena oli HiLoad Superdex 200 pg -geelisuodatuspylväs. AcATAn puhdistumista seurattiin proteiinipitoisuus- ja entsyymiaktiivisuusmittauksilla sekä SDS-PAGEn avulla.
AcATAn kiteytymiskokeissa optimoitiin olosuhteita proteiinikiteiden muodostu-miselle. Saatujen proteiinikiteiden laatua testattiin röntgendiffraktiolla (XRD). Työn aikana saatiin selville, että eri kasvatusmenetelmillä ei ollut proteiinin tuo-ton ja aktiivisuuden suhteen merkittävää eroa. Proteiinin molekyylipaino määri-tettiin, ja sen havaittiin olevan tetrameeri. XRD-kokeissa saatiin röntgendiffrak-tiokuva, joka oli hyvä alku AcATAn rakenteen selvittämiseksi. Myöhemmin Biokemian laitoksella ja Ranskassa testatuista kiteistä saatiin hyvää diffraktiotietoa, jonka avulla AcATAn rakennetta pystytään tulevaisuudessa selvittämään.