Comparative study of commercial master mixes in bacterial quantification
Lagus, Emmi (2011)
Lagus, Emmi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011060611147
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011060611147
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Alimetrics Oy:lle Espoossa. Työn päätavoitteina oli selvittää täyttävätkö polymeraasiketjureaktiossa (PCR) käytettävät kaupalliset reagenssit (master mixit) niille asetettuja laatuvaatimuksia ja ovatko kyseiset reagenssit helposti implementoitavissa eri laitteistoille ja matriiseille.
PCR on yleisesti käytetty erittäin tarkka ja monipuolinen DNA –tutkimusmenetelmä, jolla voidaan monistaa pieni määrä DNA:ta moninkertaiseksi. Kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) voidaan määrittää tarkasti näytteessä olevien bakteerien määrä, mutta reagenssien sisältämien epäpuhtauksien on havaittu häiritsevän määritystä sekä estävän hyvin pieniä bakteerimääriä sisältävien näytteiden luotettavan analysoinnin. Lisäksi sekä reagenssin että laitteiston vaihto vaatii työläitä ja lisäkustannuksia tuovia optimointeja. Kuluttajan kannalta olisi olennaista löytää reagenssi, joka sisältäisi mahdollisimman vähän epäpuhtauksia ja olisi helposti toteutettavissa eri laitteistoilla tarpeen niin vaatiessa.
Työssä verrattiin neljää SYBR Green –kemiaan perustuvaa kaupallista reagenssia sekä kolmea PCR –laitetta. Vertailussa näytteinä olivat yhdeksän eri DNA-näytettä, kolme standardi –DNA:ta sekä kontrollit ilman DNA:ta reagenssien puhtauden määrittämiseksi. Jokainen reagenssi rinnakkaisnäytteineen testattiin jokaisella laitteella.
Tulosten mukaan mikään verratuista reagensseista ei ollut täysin puhdas, vaan sisälsivät reagenssien mukana tulevaa vierasta DNA:ta, joka voitiin havaita DNA:n monistumisena kontrollinäytteissä. Tämän vuoksi testatut reagenssit eivät myöskään olleet ideaalisia matriiseille joiden tiedettiin sisältävän vain vähän DNA:ta. Lisäksi myös laitteistolla todettiin olevan eroja samalla reagenssilla testattuna. Näin ollen mikään verratuista tuotteista ei täytä toivottuja puhtauskriteerejä eivätkä reagenssit ole suoraan implementoitavissa eri laitteiden kesken.
PCR on yleisesti käytetty erittäin tarkka ja monipuolinen DNA –tutkimusmenetelmä, jolla voidaan monistaa pieni määrä DNA:ta moninkertaiseksi. Kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) voidaan määrittää tarkasti näytteessä olevien bakteerien määrä, mutta reagenssien sisältämien epäpuhtauksien on havaittu häiritsevän määritystä sekä estävän hyvin pieniä bakteerimääriä sisältävien näytteiden luotettavan analysoinnin. Lisäksi sekä reagenssin että laitteiston vaihto vaatii työläitä ja lisäkustannuksia tuovia optimointeja. Kuluttajan kannalta olisi olennaista löytää reagenssi, joka sisältäisi mahdollisimman vähän epäpuhtauksia ja olisi helposti toteutettavissa eri laitteistoilla tarpeen niin vaatiessa.
Työssä verrattiin neljää SYBR Green –kemiaan perustuvaa kaupallista reagenssia sekä kolmea PCR –laitetta. Vertailussa näytteinä olivat yhdeksän eri DNA-näytettä, kolme standardi –DNA:ta sekä kontrollit ilman DNA:ta reagenssien puhtauden määrittämiseksi. Jokainen reagenssi rinnakkaisnäytteineen testattiin jokaisella laitteella.
Tulosten mukaan mikään verratuista reagensseista ei ollut täysin puhdas, vaan sisälsivät reagenssien mukana tulevaa vierasta DNA:ta, joka voitiin havaita DNA:n monistumisena kontrollinäytteissä. Tämän vuoksi testatut reagenssit eivät myöskään olleet ideaalisia matriiseille joiden tiedettiin sisältävän vain vähän DNA:ta. Lisäksi myös laitteistolla todettiin olevan eroja samalla reagenssilla testattuna. Näin ollen mikään verratuista tuotteista ei täytä toivottuja puhtauskriteerejä eivätkä reagenssit ole suoraan implementoitavissa eri laitteiden kesken.