Kvantitatiivisen RT-PCR -menetelmän validointi Parechovirusten tunnistamiseksi
Aatola, Heli (2012)
Aatola, Heli
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012100414179
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012100414179
Tiivistelmä
Parechovirukset ovat sekä ihmisiä että eläimiä infektoivia pieniä RNA-viruksia. Vaikka 95 % aikuisista Suomessa kantaa viruksen vasta-aineita, on parechovirusinfektioita tutkittu vasta viime vuosina. HPeV-infektio sairastetaan useimmiten alle yksivuotiaana. Infektio voi olla oireeton, aiheuttaa lieviä suolisto- ja hengitystieoireita tai johtaa vakaviin tulehdustiloihin, kuten aivokalvontulehdukseen.
Parechovirustartunta voidaan tunnistaa uloste-, nenänielu- tai likvor-näytteestä nopeasti ja luotettavasti RT-qPCR –menetelmällä. HPeV-infektion diagnosointiin kehitetty menetelmä on tarkoitus ottaa käyttöön Turun yliopiston UTULab-diagnostiikkalaboratoriossa. Laboratorion akkreditiointi edellyttää kuitenkin uusien menetelmien validointia ennen käyttöönottoa.
Opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida ja validoida HPeV RT-qPCR –menetelmä, jotta se voidaan ottaa osaksi UTULabin tarjoamaa tutkimusvalikoimaa. RT-qPCR –menetelmille ei ole julkaistu selkeitä validointiohjeita, joten osana työtä oli validointisuunnitelman laatiminen. Validoitaviksi parametreiksi valittiin analyyttinen spesifisyys, herkkyys, toistotarkkuus, oikeellisuus sekä lineaarisuus ja määritysalue.
RT-reaktio, qPCR-reaktiossa käytettävä alukepari ja PCR-tuotteen leimausmenetelmä optimoitiin ennen validointia. Validoitavaan menetelmään valittiin testiajojen perusteella Fermentaksen RT-reaktion reagenssit ja K30-aluke sekä qPCR-reaktioon julkaisematon forward-aluke ja SYBR Green –leima.
Validointiajoilla todettiin, että menetelmä antaa positiivisen tuloksen eri lähteistä eristetyille HPeV-näytteille sekä negatiivisen tuloksen enteropositiivisille näytteille sekä näytematriiseille. Menetelmän herkkyydeksi saatiin 101-100 K/µl ja lineaariseksi alueeksi 101-104 K/µl. Menetelmän toistotarkkuus ja oikeellisuus olivat hyväksyttävissä rajoissa. qPCR-reaktion keskimääräinen tehokkuus oli 87 %. Validointiajojen perusteella RT-qPCR –menetelmä parechovirusten tunnistamiseksi on riittävän luotettava, herkkä sekä toistettava otettavaksi diagnostiseen käyttöön.
Parechovirustartunta voidaan tunnistaa uloste-, nenänielu- tai likvor-näytteestä nopeasti ja luotettavasti RT-qPCR –menetelmällä. HPeV-infektion diagnosointiin kehitetty menetelmä on tarkoitus ottaa käyttöön Turun yliopiston UTULab-diagnostiikkalaboratoriossa. Laboratorion akkreditiointi edellyttää kuitenkin uusien menetelmien validointia ennen käyttöönottoa.
Opinnäytetyön tavoitteena oli optimoida ja validoida HPeV RT-qPCR –menetelmä, jotta se voidaan ottaa osaksi UTULabin tarjoamaa tutkimusvalikoimaa. RT-qPCR –menetelmille ei ole julkaistu selkeitä validointiohjeita, joten osana työtä oli validointisuunnitelman laatiminen. Validoitaviksi parametreiksi valittiin analyyttinen spesifisyys, herkkyys, toistotarkkuus, oikeellisuus sekä lineaarisuus ja määritysalue.
RT-reaktio, qPCR-reaktiossa käytettävä alukepari ja PCR-tuotteen leimausmenetelmä optimoitiin ennen validointia. Validoitavaan menetelmään valittiin testiajojen perusteella Fermentaksen RT-reaktion reagenssit ja K30-aluke sekä qPCR-reaktioon julkaisematon forward-aluke ja SYBR Green –leima.
Validointiajoilla todettiin, että menetelmä antaa positiivisen tuloksen eri lähteistä eristetyille HPeV-näytteille sekä negatiivisen tuloksen enteropositiivisille näytteille sekä näytematriiseille. Menetelmän herkkyydeksi saatiin 101-100 K/µl ja lineaariseksi alueeksi 101-104 K/µl. Menetelmän toistotarkkuus ja oikeellisuus olivat hyväksyttävissä rajoissa. qPCR-reaktion keskimääräinen tehokkuus oli 87 %. Validointiajojen perusteella RT-qPCR –menetelmä parechovirusten tunnistamiseksi on riittävän luotettava, herkkä sekä toistettava otettavaksi diagnostiseen käyttöön.