Generation of K581A Mutation and Production of Recombinant JAK2 Protein
Hovinen, Emilia (2012)
Hovinen, Emilia
Tampereen ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012121018791
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012121018791
Tiivistelmä
Protein kinases are a large group of enzymes that play a major role in regulating signalling processes, DNA replication and transcription, cell differentiation and carbohydrate and lipid metabolism. JAKs are members of the Janus kinase family belonging to the group of non-receptor tyrosine kinases. The research group, led by Olli Silvennoinen, investigates the JAK-STAT signaling pathway, which regulates gene expression by mediating extracellular signals to nucleus via cell-surface receptors. Several cytokines and hormones activate the JAK-STAT pathway and its dysfunction affect the cell’s ability to differentiate, proliferate, develop and survive. The objective of this study was to investigate the solubility, structure and function of kinase domain (JH1) and pseudokinase domain (JH2) of JAK2 protein. The purpose was to generate a kinase inactivating mutation K581A in the pseudokinase domain and produce recombinant JAK2 protein in Baculosystem.
JAK2 is an essential protein in erythropoiesis and myeloid differentiation. Mutations in JAK2 affect its structure and function in the JAK-STAT pathway, leading to myeloproliferative diseases. The production of inactive and soluble proteins has shown to be a difficult task. In this study, bac-to-bac expression system was used to produce desired recombinant proteins. Two different sizes of mutated DNA -constructs were transformed into competent DH10Bac cells for generating recombinant bacmid DNA, which was isolated and transfected into Sf9 cells. Fresh insect cells were infected with the baculovirus particles harvested from media. Western blot results indicate that the insect cells were able to express the mutant JAK2 -protein but not in soluble form.
The aim of the thesis was to produce stable and soluble protein which can be used in structural studies of two-domain JAK2. The mutations, K581A and D976N together could have interfered with the stability of the JAK2 and induce the protein insoluble. The catalytical activity of JAK2 is regulated by tyrosine residue phosphorylation in the kinase domain and only the crystal structures of pseudokinase (JH2) and kinase (JH1) domain have been resolved. In the future, more recombinant protein production is required for X-ray crystallography studies which will give more information on the three-dimensional structure and catalytic activity of JAK2 and allow the development of new therapeutic drugs for a trial. The constructs can be used again to produce high amounts of recombinant proteins, which can be purified for structural studies. JAK-kinaasit ovat entsyymejä, joilla on tärkeä rooli solusignaloinnin säätelyssä, DNA:n kahdentumisessa ja transkriptiossa sekä solujen kyvyssä lisääntyä ja erilaistua. Janus kinaasit ovat sytokiinireseptoreihin sitoutuvia tyrosiinikinaaseja, jotka välittävät sytokiinin signaalin solun sisään autofosforylaation sekä solunsisäisten signalointireittien aktivoitumisen kautta. Professori Olli Silvennoisen tutkimusryhmä selvittää JAK-kinaasien säätelymekanismeja immuunivastetta heikentävissä sairauksissa. Sytokiinireseptorien avulla JAK-STAT signaaliketju säätelee geenien ilmentymistä välittämällä solun ulkopuolisia signaaleja tumaan. Useat sytokiinit ja hormonit aktivoivat JAK-STAT signaaliketjua. Häiriöt signaaliketjun toiminnassa vaikuttavat solun kykyyn lisääntyä, erilaistua, kehittyä ja selviytyä.
JAK2-proteiinilla on tärkeä tehtävä erytropoieesissa ja myeloidisten solulinjojen erilaistumisessa. JAK2:ssa esiintyvien mutaatioiden on todettu aiheuttavan rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia proteiinissa sekä johtavan erilaisiin myeloproliferatiivisiin sairauksiin. JAK2:n biologista ja rakenteellista tutkimusta on hidastanut sen epästabiili rakenne, minkä vuoksi proteiinista haluttiin mutaatioiden avulla inaktiivinen. Opinnäytetyön tarkoituksena oli luoda JAK2:n pseudokinaasiosaan eli JH2-domeeniin inaktivoiva K581A-mutaatio ja tuottaa rekombinanttia proteiinia bakulovirussysteemissä. Työn tavoitteena oli analysoida tuotettujen JAK2-domeenien liukoisuutta sekä tutkia niiden kolmiulotteista rakennetta ja toimintaa. Proteiinia tuotettiin Bac-to-Bac® Baculovirus Expression Systemtuottosysteemillä. Kompetentit E. coli-solut transformoitiin mutatoidulla plasmidilla rekombinantin bakmidin aikaansaamiseksi, minkä jälkeen bakmidi-DNA eristettiin. Sf9-hyönteissolulinja transfektoitiin eristetyllä ja puhdistetulla bakmidi-DNA:lla, ja solut alkoivat tuottaa haluttua rekombinanttiproteiinia.
Hyönteissoluissa tuotetut proteiinit analysoitiin Western blot -menetelmällä. Solut kykenivät ilmentämään haluttua proteiinia, mutta molemmat JAK2-konstruktit osoittautuivat liukenemattomiksi. Liukoisten ja inaktiivisten proteiiniosien tuottaminen laboratoriossa on osoittautunut haastavaksi. Ilmeisesti K581A- ja D976N-mutaatioiden samanaikainen läsnäolo häiritsi tutkittavan proteiinin stabiilisuutta ja aiheutti sen liukenemattomuuden. Mutatoituja konstrukteja voidaan jatkossa tuottaa uudelleen esimerkiksi jollakin toisella tuottosysteemillä, minkä jälkeen proteiinia voidaan puhdistaa rakenteellista tutkimusta varten.
JAK2 is an essential protein in erythropoiesis and myeloid differentiation. Mutations in JAK2 affect its structure and function in the JAK-STAT pathway, leading to myeloproliferative diseases. The production of inactive and soluble proteins has shown to be a difficult task. In this study, bac-to-bac expression system was used to produce desired recombinant proteins. Two different sizes of mutated DNA -constructs were transformed into competent DH10Bac cells for generating recombinant bacmid DNA, which was isolated and transfected into Sf9 cells. Fresh insect cells were infected with the baculovirus particles harvested from media. Western blot results indicate that the insect cells were able to express the mutant JAK2 -protein but not in soluble form.
The aim of the thesis was to produce stable and soluble protein which can be used in structural studies of two-domain JAK2. The mutations, K581A and D976N together could have interfered with the stability of the JAK2 and induce the protein insoluble. The catalytical activity of JAK2 is regulated by tyrosine residue phosphorylation in the kinase domain and only the crystal structures of pseudokinase (JH2) and kinase (JH1) domain have been resolved. In the future, more recombinant protein production is required for X-ray crystallography studies which will give more information on the three-dimensional structure and catalytic activity of JAK2 and allow the development of new therapeutic drugs for a trial. The constructs can be used again to produce high amounts of recombinant proteins, which can be purified for structural studies.
JAK2-proteiinilla on tärkeä tehtävä erytropoieesissa ja myeloidisten solulinjojen erilaistumisessa. JAK2:ssa esiintyvien mutaatioiden on todettu aiheuttavan rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia proteiinissa sekä johtavan erilaisiin myeloproliferatiivisiin sairauksiin. JAK2:n biologista ja rakenteellista tutkimusta on hidastanut sen epästabiili rakenne, minkä vuoksi proteiinista haluttiin mutaatioiden avulla inaktiivinen. Opinnäytetyön tarkoituksena oli luoda JAK2:n pseudokinaasiosaan eli JH2-domeeniin inaktivoiva K581A-mutaatio ja tuottaa rekombinanttia proteiinia bakulovirussysteemissä. Työn tavoitteena oli analysoida tuotettujen JAK2-domeenien liukoisuutta sekä tutkia niiden kolmiulotteista rakennetta ja toimintaa. Proteiinia tuotettiin Bac-to-Bac® Baculovirus Expression Systemtuottosysteemillä. Kompetentit E. coli-solut transformoitiin mutatoidulla plasmidilla rekombinantin bakmidin aikaansaamiseksi, minkä jälkeen bakmidi-DNA eristettiin. Sf9-hyönteissolulinja transfektoitiin eristetyllä ja puhdistetulla bakmidi-DNA:lla, ja solut alkoivat tuottaa haluttua rekombinanttiproteiinia.
Hyönteissoluissa tuotetut proteiinit analysoitiin Western blot -menetelmällä. Solut kykenivät ilmentämään haluttua proteiinia, mutta molemmat JAK2-konstruktit osoittautuivat liukenemattomiksi. Liukoisten ja inaktiivisten proteiiniosien tuottaminen laboratoriossa on osoittautunut haastavaksi. Ilmeisesti K581A- ja D976N-mutaatioiden samanaikainen läsnäolo häiritsi tutkittavan proteiinin stabiilisuutta ja aiheutti sen liukenemattomuuden. Mutatoituja konstrukteja voidaan jatkossa tuottaa uudelleen esimerkiksi jollakin toisella tuottosysteemillä, minkä jälkeen proteiinia voidaan puhdistaa rakenteellista tutkimusta varten.