Mikro-RNA:iden vaikutus nisäkässolujen solukalvon fosfolipidihomeostasiaan
Tuukkanen, Marika (2013)
Tuukkanen, Marika
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201305199447
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201305199447
Tiivistelmä
Tämä insinöörityö tehtiin osana Helsingin Yliopiston lipiditutkimusryhmän miRNA-projektia. Projektin tavoitteena on tutkia, ovatko mikro-RNA:t osallisina solukalvon fosfolipidihomeostasian ylläpidossa.
Nisäkässoluja ja niiden soluorganelleja ympäröi solukalvo, joka muodostuu kaksoislipidikerroksesta. Suurin osa nisäkässolujen lipideistä on glyserofosfolipidejä (GPL). Näistä yleisimmin esiintyvät fosfatidyylikoliini (PC) ja fosfatidyylietanoliamiini (PE) valittiin tämän työn kohteiksi. Tiedetään, että solukalvon lipidikoostumus on hyvin tarkasti säädeltyä, mutta varmuutta siitä, mitkä tekijät ovat osallisina tässä säätelyssä, ei vielä tiedetä.
Mikro-RNA:t ovat pieniä, yksijuosteisia, ei-koodaavia RNA:ita. Ihmisen miRNA:iden arvellaan kontrolloivan yli 60 %:a kaikista proteiinia koodaavista geeneistä. miRNA:iden on osoitettu kontrolloivan useita biologisia toimintoja, kuten kehitystä, erilaistumista, metaboliaa, kasvua, lisääntymistä ja apoptoosia. Mikro-RNA:iden on todettu olevan osallisina esimerkiksi kolesterolihomeostasian säätelyssä, joten nyt tutkittiin, olisiko niillä samantyyppisiä vaikutuksia myös fosfolipidihomeostasiaan.
Mikro-RNA:iden mahdollisia vaikutuksia solukalvon fosfolipidihomeostasiaan tutkittiin hiljentämällä HeLa-soluista miRNA-biogeneesireitin keskeiset entsyymit Dicer ja Drosha. Western blot -menetelmän avulla tutkittiin, onko Dicer- ja Drosha- hiljennetyissä soluissa tapahtunut muutoksia fosfolipidien synteesireittien entsyymien ekspressiossa. Samalla tavalla tutkittiin myös keskeisten fosfolipaasien ekspressiotasoja. Lisäksi tutkittiin, miten eksogeeniset fosfolipidit vaikuttavat fosfolipaasien ja synteettisten entsyymien toimintaan.
Western blot -menetelmällä tutkittiin yhteensä yhdeksän eri entsyymin ilmenemistasot. Dicer- ja Drosha-hiljennetyissä soluissa yhden synteettisen entsyymin, fosfokoliinisytidylyy-litransferaasin (CT), ekspressio kohosi merkittävästi. Eksogeenisistä lipideistä fosfatidyyliseriinin (PS) havaittiin vaikuttavan solukalvon fosfolipidihomeostasiaan siten, että kun solussa on ylimäärin PS:ää, CDP-etanoliamiiinireitin entsyymien eksperssio laskee ja fosfatidyylietanoliamiinia (PE) tuotetaan ensisijaisesti dekarboksyloimalla PS:ä.
Nisäkässoluja ja niiden soluorganelleja ympäröi solukalvo, joka muodostuu kaksoislipidikerroksesta. Suurin osa nisäkässolujen lipideistä on glyserofosfolipidejä (GPL). Näistä yleisimmin esiintyvät fosfatidyylikoliini (PC) ja fosfatidyylietanoliamiini (PE) valittiin tämän työn kohteiksi. Tiedetään, että solukalvon lipidikoostumus on hyvin tarkasti säädeltyä, mutta varmuutta siitä, mitkä tekijät ovat osallisina tässä säätelyssä, ei vielä tiedetä.
Mikro-RNA:t ovat pieniä, yksijuosteisia, ei-koodaavia RNA:ita. Ihmisen miRNA:iden arvellaan kontrolloivan yli 60 %:a kaikista proteiinia koodaavista geeneistä. miRNA:iden on osoitettu kontrolloivan useita biologisia toimintoja, kuten kehitystä, erilaistumista, metaboliaa, kasvua, lisääntymistä ja apoptoosia. Mikro-RNA:iden on todettu olevan osallisina esimerkiksi kolesterolihomeostasian säätelyssä, joten nyt tutkittiin, olisiko niillä samantyyppisiä vaikutuksia myös fosfolipidihomeostasiaan.
Mikro-RNA:iden mahdollisia vaikutuksia solukalvon fosfolipidihomeostasiaan tutkittiin hiljentämällä HeLa-soluista miRNA-biogeneesireitin keskeiset entsyymit Dicer ja Drosha. Western blot -menetelmän avulla tutkittiin, onko Dicer- ja Drosha- hiljennetyissä soluissa tapahtunut muutoksia fosfolipidien synteesireittien entsyymien ekspressiossa. Samalla tavalla tutkittiin myös keskeisten fosfolipaasien ekspressiotasoja. Lisäksi tutkittiin, miten eksogeeniset fosfolipidit vaikuttavat fosfolipaasien ja synteettisten entsyymien toimintaan.
Western blot -menetelmällä tutkittiin yhteensä yhdeksän eri entsyymin ilmenemistasot. Dicer- ja Drosha-hiljennetyissä soluissa yhden synteettisen entsyymin, fosfokoliinisytidylyy-litransferaasin (CT), ekspressio kohosi merkittävästi. Eksogeenisistä lipideistä fosfatidyyliseriinin (PS) havaittiin vaikuttavan solukalvon fosfolipidihomeostasiaan siten, että kun solussa on ylimäärin PS:ää, CDP-etanoliamiiinireitin entsyymien eksperssio laskee ja fosfatidyylietanoliamiinia (PE) tuotetaan ensisijaisesti dekarboksyloimalla PS:ä.