PINP:n eri varianttimuotojen tutkiminen
Putila, Kirsi (2014)
Putila, Kirsi
Oulun ammattikorkeakoulu
2014
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405147723
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201405147723
Tiivistelmä
Tyypin I prokollageenin aminoterminaalinen propeptidi (PINP) muodostuu tyypin I kollageenin synteesin aikana ja erittyy verenkiertoon. Seerumista mitattava intakti-PINP on heterotrimeerinen antigeeni, joka kuvaa luun aineenvaihduntanopeutta. PINP:n patologisen eli homotrimeerisen muodon on todettu liittyvän luukudoksen eri sairauksiin sekä luustoon etäpesäkkeitä lähettäviin syöpiin. Homotrimeeriselle antigeenille ei ole tarjolla spesifistä analysointimenetelmää, mikä hidastaa sen kliinisen merkityksen selvittämistä.
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia PINP:n eri varianttimuotoja leimattujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla. Tavoitteena oli optimoida sekä vasta-aineparien että tutkittavien antigeeninäytteiden pitoisuudet siten, että vasta-aineet sitoutuisivat spesifisesti joko heterotrimeeriseen tai homotrimeeriseen PINP-varianttiin. Analysoinneissa käytettiin Oulun yliopiston Diagnostiikan laitoksen Kliinisen kemian laboratoriossa olevaa IDS-iSYS-analysaattoria, jonka analysointimenetelmä perustuu vasta-aineeseen liitetyn merkkiaineen hajoamisessa emittoituvan valon määrän mittaamiseen (kemiluminesenssi).
Tutkittavat PINP-näytteet puhdistettiin pleura- ja askitesnesteistä kromatografisilla menetelmillä. Toimeksiantajan laboratoriossa aikaisemmin tehdyn tutkimuksen perusteella valitut vasta-aineet leimattiin joko biotiinilla tai akridiumesterillä. Vasta-aineiden pitoisuusoptimoinnin jälkeen leimaparien toimivuutta testattiin analysoimalla niiden sitoutuminen puhdistettuihin soluviljelynäytteisiin sekä denaturoituihin antigeeninäytteisiin. PINP-näytteiden puhtautta ja antigeenien rakennetta arvioitiin lisäksi geelielektroforeesin avulla.
Työn tuloksena saatiin optimoitua kolme erilaista vasta-aineparia, joilla mitattaessa PINP-näytteet titraantuivat tavoitteiden mukaisesti. Vasta-aineparit sitoutuivat hyvin soluviljelynäytteiden antigeeneihin, eli leimapareja on mahdollista käyttää apuna eri solulinjojen tutkimisessa. Vasta-aineiden sitoutuminen kohdeantigeeniin inhiboitui lämpödenaturoinnin seurauksena, eli menetelmä on herkkä antigeenin rakenteen muutoksille. Lisäksi työn aikana leimattujen vasta-aineiden todettiin olevan herkkiä pakastus-sulatussyklin toistumiselle. Työn tuloksia on mahdollista käyttää eri PINP-variantit erottelevan automaattisen analysointimenetelmän jatkokehityksessä ja pystytyksessä.
Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia PINP:n eri varianttimuotoja leimattujen monoklonaalisten vasta-aineiden avulla. Tavoitteena oli optimoida sekä vasta-aineparien että tutkittavien antigeeninäytteiden pitoisuudet siten, että vasta-aineet sitoutuisivat spesifisesti joko heterotrimeeriseen tai homotrimeeriseen PINP-varianttiin. Analysoinneissa käytettiin Oulun yliopiston Diagnostiikan laitoksen Kliinisen kemian laboratoriossa olevaa IDS-iSYS-analysaattoria, jonka analysointimenetelmä perustuu vasta-aineeseen liitetyn merkkiaineen hajoamisessa emittoituvan valon määrän mittaamiseen (kemiluminesenssi).
Tutkittavat PINP-näytteet puhdistettiin pleura- ja askitesnesteistä kromatografisilla menetelmillä. Toimeksiantajan laboratoriossa aikaisemmin tehdyn tutkimuksen perusteella valitut vasta-aineet leimattiin joko biotiinilla tai akridiumesterillä. Vasta-aineiden pitoisuusoptimoinnin jälkeen leimaparien toimivuutta testattiin analysoimalla niiden sitoutuminen puhdistettuihin soluviljelynäytteisiin sekä denaturoituihin antigeeninäytteisiin. PINP-näytteiden puhtautta ja antigeenien rakennetta arvioitiin lisäksi geelielektroforeesin avulla.
Työn tuloksena saatiin optimoitua kolme erilaista vasta-aineparia, joilla mitattaessa PINP-näytteet titraantuivat tavoitteiden mukaisesti. Vasta-aineparit sitoutuivat hyvin soluviljelynäytteiden antigeeneihin, eli leimapareja on mahdollista käyttää apuna eri solulinjojen tutkimisessa. Vasta-aineiden sitoutuminen kohdeantigeeniin inhiboitui lämpödenaturoinnin seurauksena, eli menetelmä on herkkä antigeenin rakenteen muutoksille. Lisäksi työn aikana leimattujen vasta-aineiden todettiin olevan herkkiä pakastus-sulatussyklin toistumiselle. Työn tuloksia on mahdollista käyttää eri PINP-variantit erottelevan automaattisen analysointimenetelmän jatkokehityksessä ja pystytyksessä.