DNA-eristysmenetelmän kehitys papaijalle ja pellavansiemenelle, ja papaijan PCRmenetelmän validoinnin aloitus

Abstract

Tässä opinnäytetyössä tutkittiin eri DNA-eristysmenetelmien toimivuutta papaijalle (Carica papaya) ja pellavansiemenelle (Linum usitatissimum). Menetelminä olivat Tullilaboratoriolla normaalissa käytössä olevat Biotecon Foodproof Preparation Kit III ja kaksi eri CTABmenetelmää, joita muokattiin edelleen tarpeen mukaan. Näytteitä esikäsiteltiin monella tavalla, jotta selvisi, mikä tapa olisi tietylle matriisille paras. Kaikki eristetty DNA analysoitiin reaaliaikaisella PCR-laitteella (qPCR), jossa näytteen CT-arvoa verrattiin tarkkailunäytteisiin. Tämän lisäksi työssä aloitettiin papaijan PCR-menetelmän validointiprosessia selvittämällä sen spesifisyyttä ja herkkyyttä. Työ tehtiin Tullilaboratorion Elintarviketutkimukset II -jaostolle.

Kaupallisella Biotecon-kitillä ei voitu eristää papaijasta DNA:ta, joka ei sisältänyt ilmeisiä polymeraasireaktioita inhiboivia aineita. Edes hyvän puhtausarvon antaneet näytteet eivät monistuneet hyvin. Käyttäen muokattua versiota Adam Healeyn suunnittelemasta CTABmenetelmästä siemenettömästä ruokapapaijasta ja raakapapaijasta saatiin eristettyä kohtalaisella saannolla hyvin puhdasta DNA:ta, joka monistui hyvin qPCR:ssä. Pellavansiemenistä ei onnistuttu millään menetelmällä eristämään monistuskelpoista DNA:ta. Saannot siitä olivat joka menetelmällä korkeita, mutta puhtausarvot olivat erittäin huonoja ja monistus huonoa. CTAB-menetelmät eivät eristäneet hyväksyttävän laatuista DNA:ta soijapaputarkkailunäytteistä, joten menetelmät vaativat vielä säätöä.

Papaijan PCR-menetelmä todettiin spesifiseksi 18 muun kasvin ja kahden eläimen DNA:ta vastaan. Herkkyyttä kokeiltiin viidellä eri kymmenkertaisella kopiomäärätasolla kuudella toistolla. 10 000-, 1 000- ja 100- kopioiset kaivot monistuivat noin 3,33 syklin välillä toisistaan oletetusti. 10-kopioiset kaivot monistuivat 2,7 sykliä 100 kopioisten jälkeen. 1 kopioiset kaivot eivät monistuneet ollenkaan. Papaijan PCR-menetelmän toteamisrajaksi todettiin 10 kopiota.

In this thesis, the effect of different DNA-extraction methods was studied on the yield and purity of DNA from papaya (Carica papaya) and flaxseed (Linum usitatissimum). The methods used were a commercial Biotecon Foodproof preparation Kit III and two different CTAB-based methods on which modifications were made as necessary. The samples were pretreated in multiple ways to see if one might prove superior to the other. All extracted DNA was analyzed using real-time PCR (qPCR) and their crossing thresholds were compared to standardized samples used by the Finnish Customs Laboratory. Early work on the validation process of the PCR method for papaya was also conducted by measuring the specificity and sensitivity of the method. This thesis was done for the GMO department of the Finnish Customs laboratory.

The Biotecon commercial kit proved unable to extract DNA from papaya that did not contain apparent PCR-inhibiting components. Even samples with a good A260/A280 ratio did not seem to properly multiply in PCR and had a poor CT-value. Seedless ripe papaya and unripe papayas yielded very pure DNA in moderate quantities that worked in qPCR using a modified version of the CTAB-method devised by Adam Healey in 2014. Flaxseed yielded extremely high amounts of DNA with all methods, but was generally impure and did not multiply very well in PCR. At no point did either CTAB-method yield acceptable results with a soybean-standard sample and require further adjustments.

The PCR-method for papaya was tested against 18 different plant DNA-samples and two animal samples (human and tuna) and was found to be specific. Its sensitivity was tested using six replicates of five different levels of tenfold dilutions. From 10 000 copies to 100, a replication cycle difference of ~3,33 was observed between tenfold dilutions. Wells with 10 copies crossed the threshold of ~2,7 cycles earlier and wells with just 1 copy did not multiply at all; therefore the limit of detection for this method was determined to be 10 copies.