Laktoosi-intoleranssin määrittäminen RT-PCR-menetelmällä : työohjeiden laatiminen bioanalyytikko-opiskelijoille

Abstract

Laktoosi-intoleranssia eli laktoosin imeytymishäiriötä esiintyy noin 17 %:lla suomalaisista. Imeytymishäiriössä suoleen ei erity tarpeeksi laktaasientsyymiä, joka pilkkoo laktoosia. Laktoosi-intoleranssi voi olla joko primaari tai sekundaarinen, joista primaari on perinnöllinen. Laktoosin sietokyky aikuisiällä on SNP-mutaatiosta johtuva. SNP-mutaatiossa laktaasigeenissä tietyllä paikalla sijaitseva emäs on vaihtunut toiseksi.

Genetiikka eli perinnöllisyystiede tutkii DNA:n siirtymistä sukupolvissa. DNA toimii kaikissa eliöissä solujen perintöaineksena. Geeni on DNA:n osa, joka sisältää ohjeen proteiinin valmistuksesta. RNA toimii varsinaisena ohjeena proteiinisynteesissä. Viisi tunnettua emästä toimii proteiinin valmistuksessa päättäen aminohappoketjun järjestyksestä. Geenimutaatioissa emäsjärjestys voi muuttua, jolloin syntyvä proteiininkin toimintatapa voi muuttua. Geenitekniikka tutkii perimää PCR-menetelmän avulla.

PCR eli polymeraasiketjureaktio monistaa DNA-templaattia. PCR-menetelmän ensimmäisen vaiheen aikana DNA hajoaa kaksoisjuosteeltaan. Toisessa vaiheessa alukkeet kiinnittyvät yksijuosteiseen DNA:han. Reaktion kolmannessa eli viimeisessä vaiheessa DNA monistuu polymeraasientsyymin avulla alukkeiden välin rajaaman alueen verran. RT-PCR-menetelmässä reaktioseokseen on lisätty fluoresoivaa väriainetta, jonka avulla reaktion etenemistä voi seurata reaaliajassa. HRM-menetelmä perustuu RT-PCR-laitteella näkyvän sulamiskäyrän analysointiin.

Opinnäytetyö tehtiin Savonia-ammattikorkeakoululle kehittämistyönä. Opinnäytetyön tarkoituksena oli tuottaa bioanalyytikko-opiskelijoille uudet työohjeet laktoosi-intoleranssin määritykseen ja tehdä optimointisuunnitelma menetelmää varten. Tavoitteena opinnäytetyössä oli tehdä selkeät ja oppimista tukevat työohjeet. Optimointisuunnitelman tavoitteena oli kehittää pohja, jonka avulla laktoosi-intoleranssitestin menetelmä pystytään optimoimaan.

Opinnäytetyön teoriaosuus käsittelee lyhyesti laktoosi-intoleranssia, perimää ja PCR-menetelmää. Teoriaosuudessa painotetaan PCR-menetelmää, sen sovelluksia ja siihen tarvittavia reaktioaineita.

Lactose intolerance as in lactose malabsorbtion occurs roughly in about 17 % of the Finnish population. In the case of malabsorbtion lactase enzyme is not secreted enough in to the intestine that breaks down lactose. Lactose intolerance can either be primary or secondary, of which the primary is hereditary. Tolerance of lactose in adulthood is caused by SNP mutation. SNP mutation is caused by switching of a single base in at a certain point of lactase gene.

Genetics examines DNA’s transition to generations. DNA works as cells´ genetic material in all organisms. A gene is a part of DNA, which contains the manual production of the protein. RNA works as a guideline for the actual protein synthesis. Five-known operating base in the manufacture of protein is deciding the amino acid sequences. In gene mutation the base sequence may change in which case the resulting protein´s way to operate may change as well. Gene technology examines genome by using the PCR method.

PCR (Polymerase Chain Reaction) clones DNA template. During PCR´s first phase DNA´s double strand breaks. In the second phase primers attach into a single stranded DNA. In the reaction´s third and final phase polymerase enzyme clones certain area of DNA defined by primers. In the RT-PCR method fluorescent dye is added into the PCR mixture which allows inspecting of the reaction in real time. The HRM method is based upon melting curve analysis which can be seen by RT-PCR machine.

Thesis was made for Savonia University of Applied Sciences as development project. The purpose of this thesis was to produce new work instructions of determining lactase intolerance for biomedical laboratory scientist students and to make an optimization plan for the method. The aim of the thesis was to make logical work instructions which support learning. The aim of the optimization plan was to create a layout with which lactase intolerance method can be optimized.

The theoretical part of this thesis shortly handles lactase intolerance, genetics and the PCR method. The main points of the theory are the PCR method, applications of PCR and reaction reagents for the PCR.