Homogeenisen kinaasimääritysmenetelmän kehittäminen tehoseulontaan

Abstract

Opinnäytetyössä tutustutaan proteiinien jälkitranslationaalisiin muokkauksiin, joista keskitytään fosforylaatioon ja erityisesti defosforylaatioon. Tavoitteena on kehittää homogeeninen vastaaineeton entsyymiaktiivisuuden määritysmenetelmä, joka käyttää hyväkseen sammutusresonanssienergiansiirtotekniikkaa (QRET). Työssä sidottiin yhteen peptidisubstraatti sekä europium-leimattu peptidi leusiinivetoketjurakenteessa. Fosfaattiryhmän ollessa kiinni peptidisubstraatissa sidosta ei synny ja reaktioseokseen lisättävä liukoinen sammutin pääsee reagoimaan europiumin kanssa sammuttaen tämän signaalin. Fosfaattiryhmä saadaan poistettua fosfataasientsyymin avulla, jolloin substraatti ja Eu-peptidi pääsevät sitoutumaan toisiinsa. Sidos estää sammuttimen reagoinnin europiumin kanssa, jolloin sammutin ei pääse sammuttamaan signaalia, ja saadaan suuri signaali. Inhibiittoreilla saadaan estettyä entsyymin toimintaa, ja työssä testattiin fosfataasientsyymin PTP1B toimintaa estäviä entsyymejä. Inhibiittori sitoutuu entsyymin aktiiviseen kohtaan ja estää substraatin sitoutumisen entsyymiin; kyseessä siis kilpaileva esto. Mittaukset tehtiin mikrotiitterilevyformaatissa mittaamalla aikaerotteista luminesenssia.

Työssä etsittiin reaktioon sopivat substraatti-, Eu-peptidi- ja entsyymikonsentraatiot. Mitattiin entsyymikinetiikkaa ja määritettiin inhibiittorien IC50 –arvot. Lisäksi tehtiin kaksoismääritys kinaasientsyymeillä, joissa käytettiin kahta eri kinaasientsyymiä sekä näille spesifisiä peptidisubstraatteja sekä inhibiittoreita. Testattiin universaalia inhibiittoria, joka estää kummankin entsyymin toimintaa.

The objective of this thesis was to study post-translational modifications, concentrating on phosphorylation and especially dephosphorylation. The aim was to develop a homogeneous, antibody-free method for enzyme activity assay which uses the quenching resonance energy transfer (QRET) technique. In this thesis, the peptide substrate and Eu-labeled peptide were bound together in a leucine zipper. When the phosphate group is attached to the peptide substrate, there is no binding and the soluble quencher added to the reaction reacts with the europium and quenches the signal. The phosphate group can be detached by phosphatase enzyme. Removing the phosphate enables the binding of the substrate and the Eu-labeled peptide. The binding prevents the quencher from reacting with the europium and it cannot quench the signal. This is how the high signal is measured. Enzyme activity can be blocked with inhibitors. In this thesis, the inhibitors blocking the phosphatase enzyme PTP1B were tested. When the inhibitor binds to the active site of the enzyme, it prevents the substrate from binding to the enzyme. This is called competitive inhibition. The measurements were performed in microtiter plate format by measuring time-resolved luminescence.

First the suitable concentrations of substrate, Eu-labeled peptide and enzyme were specified. The enzyme kinetics were measured and the IC50 values of the inhibitors were determined. Furthermore, the dual assays were performed with two different kinase enzymes and the specific peptide substrates and inhibitors for the enzymes. A universal dual inhibitor that blocks both enzymes was also tested in a reaction.