ELISA-menetelmän suunnittelu ja toteutus angiopoietiinityyppisen proteiini 4:n (Angptl-4) määrittämiseksi ihmisen verestä

Abstract

This final year project was carried out in National Public Health Institute in the Department of Molecular Medicine, in a group that studies Atherosclerosis and the metabolism involved in it. Several factors and signaling molecules participate in adipose metabolism affecting locally and secreting in blood to other organs. In this project, the focus was on one signaling molecule secreted by adipose tissue called Angiopoietin-like protein 4 (Angtl-4), which is known to interrelate directly with the quality and amount of adipose tissue and with blood serum triglyceride levels.

In the project, a construction of ELISA-method was carried out to measure Angptl-4 levels in human serum. The starting point for the study was injecting two Angptl-4 protein peptides into four rabbits to produce antibodies in the rabbit serum. The IgG-antibodies used in the immunological method were purified using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The purity of the antibodies was controlled by SDS-PAGE and antigen-binding ability was tested with Western Blot-technique. In addition some of the purified antibodies were labeled with Horseradish Peroxidase to enable their use as a secondary antibody in the ELISA-method.

The final concentration of Angptl-4 in human serum was measured by comparing fasted human serum to total protein concentration measured from fasted mouse adipose cells. It was found out in ELISA-test that the produced IgG-antibodies bound to fasted human serum Angptl-4 and also Angptl-4 was present in the adipocyte medium. The results indicated that the ELISA-test was functional but the repeatability of the measurement was not done. In order to measure Angptl-4 routinely from human serum, the method should be constructed using a whole Angptl-4 protein instead of peptides.

Tämä insinöörityö tehtiin Kansanterveyslaitoksen (KTL) molekyylilääketieteen osastolla, sydän- ja verisuonitauteja sekä niiden aineenvaihduntaa tutkivassa ryhmässä. Rasva-aineenvaihduntaan osallistuu lukuisia välittäjäaineita sekä signaalimolekyylejä, jotka vaikuttavat paikallisesti sekä kulkeutumalla veren mukana elimistön muihin osiin. Tässä työssä keskityttiin tutkimaan yhtä rasvakudoksen signaalimolekyyliä, Angiopoietiinityyppistä proteiini 4:ää (Angptl-4), jonka on todettu olevan suoraan yhteydessä rasvakudoksen laatuun ja määrään sekä plasman rasva-aineiden tasoon.

Työssä suunniteltiin ELISA-testi ihmisen Angptl-4-tason mittaamiseen seerumista. Työn lähtökohtana oli kahden Angptl-4-proteiinin peptidin injektointi neljään kaniin vasta-aineen tuottamiseksi kanin seerumissa. Tuotettu IgG-vasta-aine puhdistettiin kaniseerumista korkean resoluution nestekromatografialla (HPLC). Saatujen vasta-aineiden puhtaus testattiin SDS-PAGE-menetelmällä ja IgG-vasta-aineiden sitoutumista tutkittiin Western Blot -menetelmällä. Lisäksi osalle IgG-vasta-aineista tehtiin entsyymileimaus piparjuuriperoksidaasilla, jotta niitä voitiin käyttää ELISA-testissä sekundaarisena vasta-aineena.

Lopullinen Angptl-4-pitoisuus seerumissa määritettiin vertaamalla paastottua ihmisen seerumia paastotuista hiiriadiposyyteistä mitattuun totaaliproteiinipitoisuuteen. ELISA-testissä todettiin IgG-vasta-aineiden sitoutuvan ihmisen paastotun seerumin Angptl-4:ään, jonka lisäksi Angptl-4:n todettiin ilmenevän solujen kasvuliuoksessa. Saaduista tuloksista pääteltiin ELISA-testin toimivan hyvin, mutta riittävien toistomittausten suorittaminen jäi tekemättä. Angptl-4:n mittaamiseksi rutiininomaisesti seerumista täytyisi menetelmä kehittää kokonaiselle Angptl-4-proteiinille käytettyjen peptidipätkien sijasta.