Laadukas genominen DNA : DNA:n eristysmenetelmien vertailu rintasyöpänäytteistä

Abstract

Genomitutkimuksen tavoitteena on ymmärtää sairauksien periytymistä, syntyä ja etenemistä, sekä myös parantaa ja yksilöidä sairauksien hoidon tehoa ja seurantaa. Uusissa syöpätutkimuksissa on pystytty selvittämään syöpäalttiuden molekyyligeneettistä taustaa ja sitä kautta on saatu lisätietoa sairastumisriskeistä. Ihmisen genomi sisältää nykytiedon mukaan yli 20 000 geeniä, jotka koodaavat elämälle välttämättömiä proteiineja. Geenin altistuessa mutaatiolle on mahdollista, että syntyy ylimääräisiä, virheellisesti toimivia tai kokonaan toimimattomia proteiineja, jolloin syövän syntymekanismit saattavat aktivoitua. Näitä mutataatioita pystytään tutkimaan muun muassa sekvensoimalla geenien emäsjärjestyksiä.

Sekvensointimenetelmien kehittymisen myötä on mahdollistunut pitkien DNA-juosteiden sekvensointi. Kehitystyön ansiosta vuonna 2009 markkinoille tullut Single Molecule Real Time (SMRT) -sekvensointimenetelmä lupaa keskimäärin 21 000 juostetta yhdellä reaktiolla. SMRT-sekvensointiin soveltuvan DNA:n tulee olla riittävän suurikokoista ja puhdasta.

Opinnäytetyö on vertaileva, määrällinen tutkimus, jonka tarkoituksena oli eristää genomista DNA:ta kolmella eri menetelmällä. Tutkimuksessa vertailtiin keskenään perinteistä fenoli-kloroformiuuttoa sekä kahta kaupallista reagenssisarjaa (Agilent ja Qiagen) ja tavoitteena oli selvittää, mikä näistä menetelmistä soveltuisi parhaiten SMRT-sekvensointiin soveltuvan DNA:n eristämiseen.

Eristetyn DNA:n laatua määritettiin spektrofotometrilla, fluorometrillä, PCR:llä sekä agaroosigeelielektroforeesilla. Lisäksi työssä tarkasteltiin näytteiden säilytyksen keston vaikutusta eristetyn DNA:n laatuun, sekä eristysmenetelmien kustannusvaikuttavuutta. Työssä käytettävät lähtömateriaalit olivat rintasyöpätutkimukselle lahjoitettuja veri- ja kudosnäytteitä. Lisäksi eristykset tehtiin myös rintasyöpäsoluviljelmän soluista.

Opinnäytetyöstä saatujen tulosten perusteella voitiin todeta, että pisintä ja puhtainta DNA:ta saatiin eristettyä perin-teisellä fenoli-kloroformiuutolla. Tulosten perusteella on aloitettu rintasyöpäkudosten SMRT-sekvensointiin johtavat DNA:n eristykset.

The objective of genome-based research is to understand heredity and the development of diseases, but it also develops and improves treatments and follow up for diseases. Cancer research has identified many molecular ge-netic alterations as a background for cancer and thereby information on risks of illnesses has grown. According to current knowledge human genome contains over 20 000 genes, that code for essential proteins. Genes can be ex-posed to different kind of mutations. These mutations can cause extra, defective or entirely inactive proteins. This may lead to activating cancer genetics. Mutations can be researched by using sequencing methods.

The development of sequencing methods has enabled longer DNA-strand sequencing. The Single Molecule Real Time (SMRT) sequencing approach came on market on 2009. With SMRT long sequences, even 21 000 bases, can be sequenced in one reaction. Isolated DNA for SMRT sequencing must be pure and high-molecular weight.

This study is a comparative and quantitative research and the purpose is to isolate genomic DNA using three different methods. The study compares traditional phenol-chloroform method with two different commercial isolation kits (Agilent and Qiagen). The objective of this study is to find out which of these three methods is suited best for isolat-ing DNA when the main objective is SMRT sequencing.

The quality of the isolated DNA will be ensured by using spectrophotometer, fluorometer, PCR and agarose gel elec-trophoresis. In addition, this study regards the influence of long term storage for the quality of isolated DNA and cost-effectiveness between different isolation methods. Starting materials used in this study were donated blood and tissue samples for breast cancer research. In addition, breast cancer cell line was used.

The results of this study showed that traditional Phenol-chloroform method isolated the longest and the purest DNA. Based on these results the cancer research group has begun further research with isolating DNA from breastcancer tissue.