2,4,6-trikloorifenolilla kontaminoitujen maiden mikrobiston analysointi PCR-DGGE-menetelmällä

Abstract

Suomessa vanhojen sahojen maaperät ovat pääsääntöisesti kloorifenoleiden ja niiden epäpuhtauksien saastuttamia. Kloorifenolit päätyivät maaperään 1930–1980-luvuilla käytetyn KY-5-nimisen sahatavarassa home- ja sinistäjäsienten aiheuttamia värivikoja estävän puunsuoja-aineen käytön seurauksena. Pilaantuneen maaperän kunnostuksessa on tavallisesti käytetty massanvaihtoa, mutta kloorifenolit hajoavat myös biologisesti useiden eri mekanismien kautta.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli vertailla kolmen eri maatyypin, humus-, turve- ja kivennäismaiden, bakteeridiversiteettiä sekä 2,4,6-trikloorifenolin (2,4,6-TCP) lisäyksen vaikutuksia siihen PCR-DGGE-menetelmän avulla. Kaksois-PCR:n (nestedPCR) ensimmäisessä vaiheessa käytettiin Pseudomonas-kantoja valikoivia alukkeita ja toisessa vaiheessa universaaleita alukkeita. Bakteeridiversiteettiä arvioitiin vertailemalla sekä DGGE-geeliltä leikattuja ja sekvensoituja DNA-fragmentteja että DGGE-geelikuvioita.

Tulosten perusteella viljelemättömät alfaproteobakteerit olivat selvä enemmistö kaikissa maatyypeissä ja niitä löytyi kaikista käsittelyistä koko koejärjestelyn ajan. Tutkimuksen kohteena olleita Pseudomonas-lajeja identifioitiin eniten 2,4,6-TCP:llä käsitellyistä kivennäismaasta ja toiseksi eniten kivennäismaan kontrollista. Bakteeridiversiteetiltään kivennäismaa poikkesi selvästi humus- ja turvemaista, jotka taas keskenään olivat hyvin samanlaisia. Kaikissa maissa diversiteetti oli suurimmillaan viikkojen nolla ja neljä aikapisteissä ja väheni selvästi viikkoon kaksitoista mennessä.

2,4,6-TCP:n lisäyksellä ei ollut selvää vaikutusta maiden bakteeridiversiteettiin, sillä kontrollikokeet eivät poikenneet 2,4,6-TCP:llä käsitellyistä kokeista. Osa bakteerilajeista kuitenkin selvästi lisääntyi koejärjestelyn aikana, joten ne pystyivät sietämään ja mahdollisesti myös hyötymään kloorifenoliyhdisteen läsnäolosta.

In Finland, old saw mill sites are mainly contaminated by chlorophenols and their impurities. During the 1930s-1980s, KY-5, which contained chlorophenols, was used as a preservative to provide long-term protection of wood and timber against fungal decay and insects, with the result that chlorophenols spread to the ground. The most common remediation method for contaminated sites is mass exchange, but for soils contaminated by chlorophenols, bioremediation is also an option, because microbes can degrade chlorophenols through several degradation pathways.

The aim of this bachelor’s thesis was to analyse the bacterial diversity of three different soil types, peat, humus and mineral soils, which were artificially contaminated with 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP), using the PCR-DGGE method. The first phase of nestedPCR was done using specific Pseudomonas primers, and the second phase using universal primers. The analysis of bacterial diversity was done by comparing both DNA-fragments that were cut from DGGE and sequenced and DGGE pictures.

The results showed that the uncultured alpha proteobacters were the majority in all the three soil types, and they were found in all treatments through the whole experiment. Most of the Pseudomonas species were found in 2,4,6-TCP contaminated mineral soil and its control. Mineral soil was also clearly different by its bacterial diversity when compared to humus soil and peat, which both were very similar with each other. In all the soil types, diversity was biggest at the start point and after four weeks and clearly smaller by the end of the experiment (week 12).

Because the controls and 2,4,6-TCP contaminated soils were similar with each other, there were no clear signs of 2,4,6-TCP affecting to bacterial diversity. However, some of the bacterial species had clearly multiplied during the experiment, so some of the species were able to gain benefit from the presence of 2,4,6-TCP.