Keliakia- ja ihokeliakiaspesifisten vasta-aineiden puhdistuksen optimointi
Ahonen, Laura (2018)
Ahonen, Laura
Tampereen ammattikorkeakoulu
2018
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018101515994
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2018101515994
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin Tampereen yliopiston Keliakiatutkimuskeskukselle. Työn tavoitteena oli optimoida seerumista ja ohutsuolen limakalvon koepalan kasvatusmediumista keliakia- ja ihokeliakiaspesifisten transglutaminaasi (TG) 2- ja 3-vasta-aineiden puhdistus ja tämän jälkeen työn tarkoituksena oli käyttää menetelmää keliakia- ja ihokeliakianäytteiden puhdistukseen.
Vasta-aineita puhdistettiin affiniteettikromatografialla. Alkuun näytteiden TG2- ja TG3-vasta-ainepitoisuudet tarkastettiin ELISA:lla ja valittiin ne näytteet, joissa oli korkeat vasta-ainepitoisuudet. TG2- ja TG3-proteiinit biotinyloitiin puhdistusta varten, jonka jälkeen biotinyloiduille näytteille tehtiin SDS-PAGE ja Western blottaus. Näiden avulla todettiin, oliko biotinylointi onnistunut. Affiniteettikromatografiasta otettiin talteen puhdistuksen eluutiot ja niille tehtiin SDS-PAGE ja Western blottaus, sekä ELISA-menetelmän avulla tarkastettiin puhdistettujen vasta-aineiden spesifisyys.
Kaiken kaikkiaan vasta-aineiden puhdistuksen optimointi onnistui hyvin. Muutamaa yksittäistä menetelmää ei saatu toteutettua suunnitellulla tavalla, mutta kokonaistulokseen se ei vaikuttanut. Proteiinikonsentraatiomäärityksen tilalle otettiin käyttöön IgA- ja IgG-ELISA -menetelmät. Vasta-ainepuhdistukset ohutsuolen limakalvon koepalan kasvatusmediumnäytteistä päätettiin lopettaa muutaman testin jälkeen, sillä niiden tulokset olivat matalia ja suurin osa tuloksista jäi määritysrajan alle.
Optimoiduilla menetelmillä tehtiin vasta-ainepuhdistuksia yhteensä 15 eri keliakia- ja ihokeliakiapotilaan seeruminäytteistä. Näiden tulosten perusteella voitiin todeta, että vasta-ainepuhdistuksissa saatiin onnistuneesti puhdistettua keliakia- ja ihokeliakiaspesifisiä TG2- ja TG3-vasta-aineita. Seeruminäytteiden eluutioille pystytään tekemään lisää jatkotutkimuksia massaspektrometrilla.
Vasta-aineita puhdistettiin affiniteettikromatografialla. Alkuun näytteiden TG2- ja TG3-vasta-ainepitoisuudet tarkastettiin ELISA:lla ja valittiin ne näytteet, joissa oli korkeat vasta-ainepitoisuudet. TG2- ja TG3-proteiinit biotinyloitiin puhdistusta varten, jonka jälkeen biotinyloiduille näytteille tehtiin SDS-PAGE ja Western blottaus. Näiden avulla todettiin, oliko biotinylointi onnistunut. Affiniteettikromatografiasta otettiin talteen puhdistuksen eluutiot ja niille tehtiin SDS-PAGE ja Western blottaus, sekä ELISA-menetelmän avulla tarkastettiin puhdistettujen vasta-aineiden spesifisyys.
Kaiken kaikkiaan vasta-aineiden puhdistuksen optimointi onnistui hyvin. Muutamaa yksittäistä menetelmää ei saatu toteutettua suunnitellulla tavalla, mutta kokonaistulokseen se ei vaikuttanut. Proteiinikonsentraatiomäärityksen tilalle otettiin käyttöön IgA- ja IgG-ELISA -menetelmät. Vasta-ainepuhdistukset ohutsuolen limakalvon koepalan kasvatusmediumnäytteistä päätettiin lopettaa muutaman testin jälkeen, sillä niiden tulokset olivat matalia ja suurin osa tuloksista jäi määritysrajan alle.
Optimoiduilla menetelmillä tehtiin vasta-ainepuhdistuksia yhteensä 15 eri keliakia- ja ihokeliakiapotilaan seeruminäytteistä. Näiden tulosten perusteella voitiin todeta, että vasta-ainepuhdistuksissa saatiin onnistuneesti puhdistettua keliakia- ja ihokeliakiaspesifisiä TG2- ja TG3-vasta-aineita. Seeruminäytteiden eluutioille pystytään tekemään lisää jatkotutkimuksia massaspektrometrilla.