Reaaliaikaisen multiplex RT-PCR -menetelmän käyttöönotto ja validointi porcine reproductive and respiratory syndrome - virukselle

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli käyttöönottaa ja validoida tehokkaampi tutkimusmenetelmä porcine reproductive and respiratory syndrome -virukselle (PRRSV, sikojen lisääntymis- ja hengitystieoireyhtymävirus) entisen perinteisen PCR-menetelmän tilalle Elintarviketurvallisuusviraton (Evira) Virologian tutkimusyksikössä. Käyttöönotettu menetelmä oli reaaliaikainen multiplex RT-PCR -menetelmä, jolla voidaan todeta ja erottaa PRRS-viruksen eurooppalaista (EU) ja pohjoisamerikkalaista (NA) tyyppiä edustavat viruskannat yhtäaikaisesti.

Työ toteutettiin aiemmin julkaistun saksalaisen tutkimuksen pohjalta (Wernike, 2012a), jonka mukaan valittiin alukkeet, koettimet ja niiden pitoisuudet sekä PCR-ajo-ohjelma. Valitut alukkeet ja koettimet sekä PCR-ajo-ohjelma testattiin menetelmän käyttöönoton yhteydessä. Käyttöönoton jälkeen testi validoitiin.

Menetelmän testaus suoritettiin kumpaakin PRRS-viruksen tyyppiä (EU ja NA), edustavan prototyyppikannan laimennussarjoilla (10-1—10-8). Validointiin käytettiin kaupallista vuoden 2018 vertailututkimusnäytepaneelia, joka sisälsi PRRS-viruspositiivisia ja -negatiivisia sian seeruminäytteitä (n = 8). Lisäksi validoinnissa testattiin neljää eri matriisia, jotka olivat sian elinsuspensio, seerumi, siemenneste sekä soluviljelyelatusaine. Matriiseihin tehtiin laimennussarjat PRRS-viruksen molempia tyyppejä edustavista prototyyppikannoista ja kustakin laimennoksesta eristettiin virus-RNA. Näytteet analysoitiin käyttöönotetulla testillä.

Tuloksista määritettiin testin spesifisyys, sensitiivisyys, tarkkuus ja selektiivisyys, jotka todettiin erinomaiseksi. Toistettavuus määritettiin yhden henkilön kolmen toistokerran tuloksista lasketun variaatiokertoimen (CV %) avulla, kun taas uusittavuutta mitattiin kolmen eri henkilön toistojen tuloksista lasketun variaatiokertoimen avulla. Näillä parametreilla menetelmä todettiin toimivaksi ja validointi onnistuneeksi.

Työssä validoitu menetelmä lisätään Eviran Virologian tutkimusyksikön FINAS-akkreditoituihin reaaliaikaisiin multiplex RT-PCR -menetelmiin.

The aim of this study was to set up and validate an effective diagnostic method for Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) at Virology Research Unit of Finnish Food Safety Authority (Evira). The introduced method was real-time multiplex RT-PCR and the method replaces the old conventional PCR method. The new method is intended to detect and differentiate the European (EU) and the North American (NA) types of PRRSV simultaneously.

This study was carried out according to an earlier published German study (Wernike, 2012a) where primers and probes were obtained for the European and North American types of PRRSV. The method was tested with the selected primers and probes and PCR temperature profiles. The introduced new test was then validated.

The introduced testing method was implemented using dilution series (10-1—10-8) of PRRSV prototype strains representing European and North American types. For validation, commercial proficiency test panel was used including PRRSV positive and negative swine serum samples (n = 8). To evaluate the effect of the sample type on the test four different matrices, i.e. pig organ suspension, serum, semen and cell culture medium were tested with dilution series of both PRRSV prototypes. Virus-RNA was extracted from each dilution of each of the four matrices and tested.

Specificity, sensitivity, accuracy and selectivity of the test were determined, and excellent results were obtained. Repeatability and reproducibility were determined by coefficient of variation (CV %). The results showed that the new method was functional, and the validation was successful.

The validated real-time multiplex RT-PCR method will be included in FINAS-accredited methods of Virology Research Unit of Evira.