Acidithiobacillus-, Leptospirillum- ja Sulfobacillus-bakteerisuvuille spesifiseksi suunniteltujen alukkeiden testaaminen qPCR-menetelmällä

Abstract

Metallien talteenotossa kaivoksilla hyödynnetään usein bioliuotusta, jossa mikrobit helpottavat metallien erottamista kiviaineksesta. Bioliuotusmikrobit elävät usein ilman orgaanisia hiilenlähteitä ja saavat energiansa hapettamalla rautaa ja/tai rikkiyhdisteitä. Yleisiä kaivosympäristössä esiintyviä ja bioliuotuksessa hyödynnettäviä raudanhapettajabakteerisukuja ovat Acidithiobacillus-, Leptospirillum- ja Sulfobacillus-suvut. Edellä mainittujen raudanhapettajasukujen määrittämistä kaivosnäytteistä helpottaisi, mikäli käytettävissä olisi bakteerisuvuille spesifisiin alukepareihin perustuva qPCR-menetelmä.

Tämä opinnäyte tehtiin osana tieteellistä tutkimusprojektia Teknologian Tutkimuskeskus VTT Oy:ssä. Opinnäytteen tavoitteena oli qPCR-tekniikkaa käyttäen testata kolmen Acidithiobacillus-, Leptospirillum- tai Sulfobacillus-suvulle spesifiseksi suunnitellun alukeparin toimivuutta, käyttäen templaattina bakteeripuhdasviljelmiä sekä kaivosnäytteistä tehtyjä mikrobirikastusviljelmiä. Alukeparien toimivuutta testattiin qPCR-menetelmällä tehtyjen kvantitointien sekä sulamiskäyräanalyysien avulla.

Acidithiobacillus-suvulle suunniteltu alukepari ei toiminut riittävän luotettavasti, mutta Leptospirillum- ja Sulfobacillus-suvuille suunnitellut alukeparit osoittautuivat käyttökelpoisiksi kyseisten bakteerisukujen määrittämiseen kaivosnäytteistä.

Oppimisen kannalta tämän työn oleellisin tavoite oli perehtyä qPCR-tekniikan perusteisiin, laitteiston käyttöön ja tulosten käsittelytapoihin, jotta menetelmän käyttö olisi mielekkäämpää myös tulevissa työtehtävissä. Oppimistavoite täyttyi hyvin, sillä qPCR-laitteiston käyttö tuli tutuksi, ja työn aikana opitut tulostenkäsittelytaidot helpottavat tulevaisuudessa qPCR-määritysten arviointia itsenäisesti.

In mining, metal recovery from the ore is often facilitated by bioleaching with microorganisms. Bioleaching microbes usually live without organic carbon sources, and get their energy by oxidizing iron and/or sulphur compounds. Bacteria belonging to the genera Acidithiobacillus, Leptospirillum and Sulfobacillus are common inhabitants and bioleaching microorganisms in mines. A quantitative PCR (qPCR) method with genus specific primers would be of great value in detecting specific iron-oxidizing bacteria in mine samples.

This study was part of a scientific research project at VTT Technical Research Centre of Finland Ltd. The aim of the study was to test the performance and specificity of newly developed primer pairs specific to the genera Acidithiobacillus, Leptospirillum and Sulfobacillus, respectively, using DNA from bacterial pure cultures or enrichment cultures from mine samples as templates. The qPCR features Absolute Quantification and Melting Curve Analysis were used to test the performance of the primer pairs.

The primer pair designed to target the genus Acidithiobacillus did not prove to be specific enough for future use. The primer pairs targeting the genera Leptospirillum and Sulfobacillus, respectively, worked well to separate their specific genera from the reference microbes.

The learning objectives of the thesis were to become familiar with the qPCR basics, and the device functions, as well as to learn how to analyse the results. The learning objectives were well achieved, and now it’s easier to use the qPCR device and analyse the results independently in future work tasks.