Narkolepsian ja ihmisen mikrobiomin mahdollisen yhteyden selvittäminen NGS-sekvensointikirjaston avulla

Abstract

Opinnäytetyö tehtiin Helsingin yliopiston Biotekniikan instituutissa. Opinnäytetyö suoritettiin helsinkiläisen ja ranskalaisen tutkimusryhmän yhteistyöprojektina, jossa selvitettiin ulostenäytteitä tutkimalla mahdollista yhteyttä narkolepsian ja ihmisen mikrobiomin välillä. Tutkimuksessa oli mukana näytteitä narkolepsiaa sairastavilta henkilöiltä, näytteitä henkilöiltä, joilla oli todettu muunlaista hypersomniaa, ja näytteitä terveiltä henkilöiltä.

Biotekniikan instituutissa on aiemmin suoritettu Parkinsonin tautiin liittyvää tutkimusta, jossa on selvitetty Parkinsonin taudin ja ihmisen suoliston mikrobiomin välistä korrelaatiota. Tämän perusteella on todistettu, että ihmisen suoliston mikrobiomista löytyy eroavaisuuksia terveiden ja Parkinsonin tautia sairastavien henkilöiden välillä.

Projekti aloitettiin näytteiden lajittelulla ja merkitsemisellä, jonka jälkeen suoritettiin DNA:n eristäminen kaupallisen kitin protokollan mukaan. Eristetyille DNA-näytteille tehtiin kaksivaiheinen PCR, jossa ensimmäisessä vaiheessa rajattiin spesifisillä alukkeilla monistettava osa 16S-geenistä. Toisessa vaiheessa universaalit kaksoisindeksialukkeet tunnistivat ensimmäisen PCR:n sekvensointiadapterit, jolloin muodostui pidempi fragmentti ensimmäisen vaiheen PCR-tuotteesta. Kaksoisindeksialukkeiden avulla näytteet pystyttiin identifioimaan sekvensoinnin jälkeen. 16S NGS-sekvensointikirjastoa varten PCR-tuotteet yhdistettiin yhdeksi näytepooliksi. Näytepooli puhdistettiin, minkä jälkeen määritettiin DNA-fragmenttien pituus.

Lopuksi näytteistä valmistettiin 16S NGS-sekvensointikirjasto ja näytteiden sisältämät bakteerit pystyttiin tunnistamaan. Sekvensointi suoritettiin Illumina-sekvensointimenetelmällä, jossa halutusta geenialueesta saatiin monistettua tuhansia sekvenssejä myöhempää bioinformatiivista analysointia varten, jossa sekvenssejä verrataan tunnettuun genomiin. Tämän perusteella voidaan tutkia, löytyykö narkolepsiaa sairastavien ja terveiden henkilöiden suoliston mikrobiomien väliltä eroavaisuuksia.

The thesis study was made at the Institute of Biotechnology of the University of Helsinki. The study was executed as a collaborative project with research groups in France and Helsinki, to explore the probability of connection between narcolepsy and human microbiome by studying fecal samples. In this study narcoleptic samples, samples with hypersomnia and samples from healthy persons where used.

There has been previous research at the Institute of Biotechnology concerning the correlation between Parkinson`s disease and gut microbiota from different bacteria species. By these studies it has been shown that there are differences in gut microbiota between healthy persons and persons that suffer from Parkinson`s disease.

The study was started by sorting and labeling samples, followed by DNA extraction according to the commercial kit protocol. The extracted DNA-samples were subjected to two-phase PCR, where in the first phase, part of the 16s-gene were amplified with specific primers. In the second phase, universal dual index-primers adhered to first phase sequence adapters and they formed a longer PCR-fragment from the first phase PCR-product. The samples could be identified after sequencing by dual index primers. The PCR-products were combined into one sample pool for the 16s NGS-sequencing library. Sample pool was purified and the length of DNA-fragments were measured.

Finally, the 16s NGS-sequencing library was prepared and the bacteria occuring in the samples could be identified. The sequencing method was performed as Illumina sequencing, where particular gene region can be amplified thousands of reads for later bioinformatic data analysis, where the reads are compared to known genome. Based on this information it can be explored if there are any differences between narcoleptic and healthy persons gut microbiota.