Prototyyppisen immunomäärityksen pystytys
Uotinen, Jani (2010)
Uotinen, Jani
Turun ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010120116626
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010120116626
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tarkoituksena on pystyttää immunomääritys analyytti X:n määrittämiseksi ihmisseerumista testaamalla yhdeksän eri monoklonaalisen vasta-aineen sandwich-pareja. Käytetyt vasta-aineet olivat RabMab1-3, Fab1-5 ja Mab1.
Vasta-aineiden hyödyntäminen eri analyyttien mittaamiseen perustuu niiden spesifisyyteen sitoutua omaan antigeeniinsä. Sandwich-pari koostuu kahdesta vasta-aineesta, joista toinen immobilisoidaan mikrotiitterilevyn kuoppien pohjaan. Mitattava näyte lisätään sen päälle ja analyytti kiinnittyy vasta-aineeseen. Toinen vasta-aine on ns. leima-vasta-aine, joka lisätään näytteen päälle, jättäen siten analyytin kahden vasta-aineen väliin. Leima-vasta-aineessa on mukana kelaatti, joka sisältää fluoresoivaa europiumia, mikä puolestaan voidaan mitata aikaeroitteisella fluorometrialla.
Prosessi alkoi vasta-aineiden puhdistamisella kasvatusliuoksistaan käyttäen affiniteettikromatografiaa, minkä jälkeen puhdistetuista vasta-aineista mitattiin niiden sitoutumiskyky eli affiniteetti. Kaikkia yhdeksää vasta-ainetta immobilisoitiin 96-kuoppaisille Nunc-mikrotiitterilevyille. Vasta-aineita, joilla oli parhain affiniteetti käytettiin leimanvalmistuksessa.
Pinnoitettuja levyjä ja leimoja testattiin ristiin parhaimman vasta-aine –sandwich-parin löytämiseksi. Menetelmää testattiin mittaamalla noin 100 pg/ml analyytti X:ää sisältävää näytettä ja tarkastelemalla siitä saatuja tuloksia.
Menetelmällä onnistuttiin löytämään lupaava sandwich-pari, mutta saatu pitoisuusmäärä vaihteli vasta-aineparin mukaan 100 pg/ml:n molemmilla puolilla. Parhain sitoutuminen oli Fab3 ja Mab1 –kombinaatiolla kummassakin orientaatiossa.
Vasta-aineiden hyödyntäminen eri analyyttien mittaamiseen perustuu niiden spesifisyyteen sitoutua omaan antigeeniinsä. Sandwich-pari koostuu kahdesta vasta-aineesta, joista toinen immobilisoidaan mikrotiitterilevyn kuoppien pohjaan. Mitattava näyte lisätään sen päälle ja analyytti kiinnittyy vasta-aineeseen. Toinen vasta-aine on ns. leima-vasta-aine, joka lisätään näytteen päälle, jättäen siten analyytin kahden vasta-aineen väliin. Leima-vasta-aineessa on mukana kelaatti, joka sisältää fluoresoivaa europiumia, mikä puolestaan voidaan mitata aikaeroitteisella fluorometrialla.
Prosessi alkoi vasta-aineiden puhdistamisella kasvatusliuoksistaan käyttäen affiniteettikromatografiaa, minkä jälkeen puhdistetuista vasta-aineista mitattiin niiden sitoutumiskyky eli affiniteetti. Kaikkia yhdeksää vasta-ainetta immobilisoitiin 96-kuoppaisille Nunc-mikrotiitterilevyille. Vasta-aineita, joilla oli parhain affiniteetti käytettiin leimanvalmistuksessa.
Pinnoitettuja levyjä ja leimoja testattiin ristiin parhaimman vasta-aine –sandwich-parin löytämiseksi. Menetelmää testattiin mittaamalla noin 100 pg/ml analyytti X:ää sisältävää näytettä ja tarkastelemalla siitä saatuja tuloksia.
Menetelmällä onnistuttiin löytämään lupaava sandwich-pari, mutta saatu pitoisuusmäärä vaihteli vasta-aineparin mukaan 100 pg/ml:n molemmilla puolilla. Parhain sitoutuminen oli Fab3 ja Mab1 –kombinaatiolla kummassakin orientaatiossa.