Kryosäilytysmenetelmän kehittäminen pensasmustikalle

Abstract

Työn tavoitteena oli luoda toimiva kryosäilytysmenetelmä pensasmustikoiden (Vaccinium corymbosum L.) silmuille. Opinnäytetyön toimeksiantaja oli Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus eli MTT ja työ toteutettiin MTT:n tiloissa Laukaan toimipisteessä. Koska pensasmustikalle ei ollut aiemmin testattu MTT:lla mitään kryosäilytysmenetelmää, päätettiin sille kokeilla muunneltua pisara-vitrifikaatiomenetelmää, joka on MTT:lla käytössä esimerkiksi mansikalla ja vadelmalla. Menetelmän kehitystä varten valittiin kolme lajiketta, joiden in vitro -viljelmistä eristettyjä silmuja käytettiin kokeissa. Optimoitavia muuttujia olivat silmun tyyppi ja koko, silmujen eristämispäivä, aktiivihiilen käyttö esikäsittelyalustalla ja esikäsittelyn välttämättömyys, sokerikäsittelyt sekä PVS2 (plant vitrification solution 2) -käsittelyaika. Työn aikana silmuja eristettiin sekä maanantaisin että perjantaisin, yhteensä noin 1200 kappaletta. Hankasilmujen pienen koon vuoksi päädyttiin eristämään vain kärkisilmuja, jotka olivat kooltaan 0,5–1,0 mm. Kokeet aloitettiin optimoimalla PVS2-käsittelyaika kahden koe-erän avulla. Koe-erissä testattiin neljää eri PVS2-käsittelyaikaa (30–60 min) kahdella lajikkeella. Parhaisiin tuloksiin molemmilla lajikkeilla päästiin 60 minuutin käsittelyajalla. Aktiivihiiltä sisältävän ja aktiivihiilettömän esikäsittelyn eroja ja esikäsittelyn välttämättömyyttä testattiin ja tulokseksi saatiin, että pensasmustikoiden silmut kannattaa eristää perjantaina ja esikäsitellä kolmen vuorokauden ajan aktiivihiiltä sisältämättömällä sakkaroosipohjaisella esikäsittelyalustalla. Lisäksi ne hyötyvät kasvavasta sokerikonsentraatiosta eli ne tulisi käsitellä vuorokauden ajan kullakin kolmesta sakkaroosipohjaisesta sokerialustasta, joiden konsentraatiot ovat 0,25 M, 0,50 M ja 0,75 M. Työn aikana ongelmiksi muodostuivat versoontuneiden silmujen luokitus, jossa ei ollut huomioitu joidenkin lajikkeiden punasävytteisyyttä, sekä kalluksen muodostus. Täydentävät kokeet olisivat tarpeen, mutta tulokseksi saatiin kuitenkin menetelmä, jolla pensasmustikan silmut saadaan kryosäilytettyä.

The goal of this research was to develop an operational cryopreservation method for highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). This thesis was executed for MTT Agrifood Research Finland at Laukaa. Modified droplet vitrification method was used because MTT had not tested any methods for cryopreserving highbush blueberries before and they already had this method in use for strawberries and raspberries. For the development of this method three cultivars of highbush blueberries were chosen and buds were isolated from in vitro -grown cultures of these cultivars. The variables that had to be optimized were the bud type and size, the isolation day of the buds, the use of active charcoal in the pretreatment and the necessity of pretreatment, sugar treatments and the PVS2 (plant vitrification solution 2) treatment time. During the research buds were isolated on both Mondays and Fridays, altogether about 1200 pieces. Because of the small size of axillary buds only apical buds, sized 0.5-1.0 mm, were isolated. The first variable to be tested was the PVS2-time. It was tested using four different times (30-60 min) and two blueberry cultivars. Both cultivars gave the best result with 60 minutes in PVS2. The pretreatment with and without active charcoal was studied as was the necessity of the pretreatment. The result was that buds should be isolated on Friday and pretreated for three days without active charcoal on a sucrose-based culture medium. They also benefit from increasing sugar concentration which means they should be treated with the 0.25 M, 0.50 M and 0.75 M sucrose-based culture medium for one day each. There were some problems during the research. The classification of sprouted buds did not take into account the natural redness of the highbush blueberries. Buds were also growing a lot of callus. Complementary tests are necessary but a functional method was created and the buds of highbush blueberries can now be cryopreserved.