Escherichia colin määritys kvantitatiivisella PCR:llä : työohje molekyylibiologian laboratorioon

Abstract

Polymeraasiketjureaktio (PCR) on paljon käytetty menetelmä, jolla on nykyään monia erilaisia käyttökohteita ja se on keskeinen menetelmä molekyylibiologian laboratoriossa. PCR-reaktiossa hyvinkin pienestä määrästä DNA:ta saadaan monistettua moninkertainen määrä samaa DNA:ta, jolloin sitä voidaan käyttää esimerkiksi diagnostisiin tarkoituksiin. Esimerkiksi mikrobiologian laboratoriossa PCR-tekniikkaa käytetään jo hyvin paljon, ja tekniikan käyttö vain lisääntyy. PCR-tekniikkaa avuksi käyttäen voidaan tunnistaa bakteereja ja monistaa DNA-jaksoja.

Kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR) pystytään mittaamaan monistettavan DNA:n määrää reaaliajassa merkkiaineiden avulla. Menetelmän etuina on sen nopeus eikä se tarvitse agaroosigeeliä tulosten tulkintaan. Esimerkiksi tiettyjen bakteereiden osoituksessa siitä on tullut jo rutiinimenetelmä.

Opinnäytetyön tavoitteena on tuottaa työohje E. colin määrityksestä kvantitatiivisella PCR-menetelmällä. Opinnäytetyön tarkoituksena on tehdä StepOnePlus™ Real-Time PCR-analysaattorilla määritys, ja tuottaa prosessista toimiva työohje. Työohje tulee Tampereen ammattikorkeakoulun molekyylibiologian laboratorioon opetuskäyttöön. Opinnäytetyö toteutetaan toiminnallisena opinnäytetyönä.

Menetelmä testattiin Tampereen ammattikorkeakoulun molekyylibiologian laboratoriossa, ja opinnäytetyö sisältää tarkempaa tietoa prosessin kulusta ja eri työvaiheista. Prosessi lähtee liikkeelle bakteerin genomin eristyksestä päättyen qPCR-määrityksen tuloksiin.

Kirjallinen osio antaa pohjatietoa PCR:n perusperiaatteista ja käyttökohteista. Materiaali on hyväksi tueksi työohjeen käyttäjälle myös laboratorioharjoituksiin. Kirjallinen osio avaa opiskelijalle testauksen eri vaiheita, joita suoritettiin työohjeen toimivuuden takaamiseksi.

Kehitysehdotuksena työohjetta tulisi testata vielä opiskelijaryhmällä, ja muokata sitä saadun palautteen mukaan. Menetelmää voisi saada kustannustehokkaammaksi optimoimalla reaktion alukkeiden ja SYBR® Greenin määriä.

Polymerase chain reaction (pcr) is widely used as a diagnostic tool in molecular biology laboratory. PCR is able to amplify very small amounts of specific DNA sequence multiple times. This amplified DNA sequence can be used to detect different kinds of bacterial and viral infections. Quantitative PCR (qPCR) can be used to detect this DNA amplification in real-time using different kind of specific fluorescent dyes or probes.

The aim of this study was to create an instruction booklet on the detection of E. coli using qPCR analysis. This was accomplished by doing detection using StepOnePlus™ Real-time analyser and creating an instruction booklet based on that detection.

This study was conducted as a practice-based study. Before creation of the instruction booklet, two laboratory tests where performed. In the first one, the qPCR reaction was tested and checked if primers or reaction conditions needed optimising. In the second test genomic DNA of E. coli was extracted and quantified using analysis. An instruction booklet was created based on the second test.

This study includes theory of PCR and qPCR main principles, an instruction booklet covering extraction of genomic DNA of E. coli and analysis of it with qPCR analyser. An instruction booklet was intended to be tested with a student group to gather feedback from them but due to time restrictions that was not possible. Possible advancements for study would be to test the instruction booklet with a student group and modify it based on the feedback obtained.