Reaaliaikaisen PCR-menetelmän ja isotermaalisen LAMP-monistuksen vertailu HLA-B27-kudosantigeenin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvän geenimutaation osoittamisessa

Abstract

Seinäjoen keskussairaalan patologian laboratoriossa tutkitaan HLA-B27-kudosantigeenin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvän mutaation esiintyminen reaaliaikaisella PCR-menetelmällä (qPCR). Reaaliaikainen PCR-menetelmä perustuu kolmivaiheeseen syklimäiseen reaktioon, jossa reaktion eri vaiheet tapahtuvat eri lämpötiloissa. Menetelmä vaatii DNA:n eristämisen ennen PCR-reaktion suorittamista. Viime vuonna markkinoille on tullut LaCAR MDx:n valmistamat isotermaaliset LAMP (Loop mediated isothermal amplification)-monistukseen perustuvat testit kudosantigeenin ja geenimutaation osoittamiseen. LAMP-monistuksessa reaktio tapahtuu isotermaalisissa olosuhteissa eli vakiolämpötilassa eikä lämpötilojen vaihtelua tapahdu. LAMP-monistus on syklimäinen itsestään jatkuva reaktio, jossa käytetään DNA-polymeraasia, jolla on kyky syrjäyttää kaksijuosteisen DNA:n toinen juoste paikoiltaan rakentaen samalla uutta vastinjuostetta syrjäytetyn tilalle.

Opinnäytetyön tarkoituksena on selvittää, vastaavatko qPCR-menetelmällä ja LAMP-monistuksella saadut tulokset toisiaan HLA-B27-kudosantigeenin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvän geenimutaation osoittamisessa. Samalla selvitetään, nopeuttavatko LaCAR MDx:n valmistamat testit vastauksen saamista. Tutkimuksen tavoitteena on ottaa uusi menetelmä rutiinikäyttöön HLA-B27-kudosantigeenin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvien geenimutaation osoittamiseen.

Tutkimuksen mukaan menetelmillä saadut tulokset vastasivat toisiaan HLA-B27-kudosantigeenin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvän geenimutaation osoittamisessa. LAMP-monistuksella HLA-B27-kudosantigeenin osoittaminen tapahtui 1 tunti 20 minuuttia nopeammin ja laktoosi-intoleranssiin liittyvän geenimutaation osoittaminen nopeutui 2 tuntia 9 minuuttia.

LAMP-monistus on tutkimuksen mukaan luotettava menetelmä ja sen avulla on mahdollista saada vastaukset nopeammin. LAMP-monistusta ei kuitenkaan oteta tällä hetkellä Seinäjoen keskussairaalan patologian laboratoriossa käyttöön, koska LAMP-monistus sisältää useita käsin tehtäviä vaiheita. Tämä lisää inhimillisten virheiden määrää ja sillä voi olla vaikutusta potilasturvallisuuteen.

Pathology Laboratory of Seinäjoki Central Hospital is testing the presence of the HLA-B27 tissue antigen and gene mutation related to lactose intolerance by real-time PCR (qPCR). LaCAR MDx has released Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assays for the detection of tissue antigen and gene mutation.

The purpose is to determine whether the results obtained by qPCR and LAMP amplification are consistent with the detection of HLA-B27 tissue antigen and gene mutation related to lactose intolerance. At the same time, it will be explored whether tests made by LaCAR MDx will speed up the response. The aim is to introduce a novel method for routine detection of HLA-B27 tissue antigen and gene mutation related to lactose intolerance.

The results obtained by the methods were consistent with the detection of HLA-B27 tissue antigen and a gene mutation related to lactose intolerance. With LAMP amplification, the detection of the HLA-B27 tissue antigen occurred 1h 20 minutes faster and the detection of the gene mutation associated with lactose intolerance accelerated 2h 9 minutes.

LAMP replication is a reliable method and provides faster answers. However, LAMP amplification is not implemented in the Pathology Laboratory of Seinäjoki Central Hospital because it involves several manual steps. In contrast, the real-time PCR method is almost fully automated. Manual steps increase the likelihood of errors and lead to poorer patient safety.