Kvantitatiiviseen qRT-PCR:ään perustuva menetelmä enterovirusten tyypittämiseksi
Liimatainen, Maija (2011)
Liimatainen, Maija
Turun ammattikorkeakoulu
2011
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011061311879
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2011061311879
Tiivistelmä
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää herkkä menetelmä, jolla tuotetaan spesifinen DNA-pala suoraan virus-RNA:sta käyttäen kvantitatiivista, reaaliaikaista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktiota (qRT-PCR).
Optimoinnissa keskityttiin enterovirusten VP1-alueen monistamiseen. Menetelmän optimointi tehtiin vaiheittain käyttäen ensin plasmidimuotoon kloonattuja virusgenomeja (PCR-vaihe) ja sitten virus-RNA:ta, joka on eristetty
tunnetuista virustyypeistä sekä ns. RNA-transkripteja, joiden kopioluku on tunnettu. Lopuksi tutkittiin kliinisiä virusnäytteitä, jotka edustavat todellista tunnistustilannetta, johon kehitettävää menetelmää aiotaan käyttää.
Työssä testattiin erilaisia kaupallisia tuotteita, joita käytetään qRT-PCR:n eri vaiheissa. Tällaisia tuotteita ovat mm. kaupalliset käänteistranskriptioentsyymit (RT-vaihe), polymeraasiketjureaktiossa käytettävät entsyymit (PCR-vaihe) ja VP1-geenin eri kohtiin sitoutuvat alukkeet. Työssä tutkittiin myös PCR-syklin eri vaiheiden pituuksien ja lämpötilojen vaikutuksia PCR-tuotteen muodostumiseen. Ajo-olosuhteita vertailtiin toisiinsa ajojen Ct-arvoja ja PCRtuotteiden sulamiskäyriä tarkastelemalla. Kehitettävän VP1-menetelmän herkkyyttä verrattiin diagnostiikassa käytettävään, ns. ENRI RT-menetelmään. Tuotteen laatu tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.
Työssä havaittiin merkittäviä eroja erilaisten kaupallisten tuotteiden välillä ja löydettiin VP1-geenin amplifiointiin sopivat olosuhteet. Kehitetyllä menetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 100 kopion herkkyys PCR-vaiheessa, kun
standardina käytetyllä ENRI RT-menetelmällä herkkyys oli 10 kopiota. Kvantitatiivinen RT-PCR -menetelmä testattiin kokonaisuudessaan eri virustyypeillä. Työssä analysoitiin 24 tunnettua virustyyppiä, joista neljälle ei saatu sulamislämpötilaa, mikä saattoi osin johtua myös koettimien
epäsopivuudesta. Lopputuloksena työssä kehitettiin herkkä qRT-PCRmenetelmä VP1-geeniin tuottamiseksi ja kvantitoimiseksi, mikä mahdollistaa isojen näytemäärien nopean käsittelyn ja hallinnan esimerkiksi epidemioiden
aikana. Jatkotutkimuksissa tulee testata ja määrittää menetelmän toimivuus tekemällä qRT-PCR-ajoja potilasnäytteistä.
Optimoinnissa keskityttiin enterovirusten VP1-alueen monistamiseen. Menetelmän optimointi tehtiin vaiheittain käyttäen ensin plasmidimuotoon kloonattuja virusgenomeja (PCR-vaihe) ja sitten virus-RNA:ta, joka on eristetty
tunnetuista virustyypeistä sekä ns. RNA-transkripteja, joiden kopioluku on tunnettu. Lopuksi tutkittiin kliinisiä virusnäytteitä, jotka edustavat todellista tunnistustilannetta, johon kehitettävää menetelmää aiotaan käyttää.
Työssä testattiin erilaisia kaupallisia tuotteita, joita käytetään qRT-PCR:n eri vaiheissa. Tällaisia tuotteita ovat mm. kaupalliset käänteistranskriptioentsyymit (RT-vaihe), polymeraasiketjureaktiossa käytettävät entsyymit (PCR-vaihe) ja VP1-geenin eri kohtiin sitoutuvat alukkeet. Työssä tutkittiin myös PCR-syklin eri vaiheiden pituuksien ja lämpötilojen vaikutuksia PCR-tuotteen muodostumiseen. Ajo-olosuhteita vertailtiin toisiinsa ajojen Ct-arvoja ja PCRtuotteiden sulamiskäyriä tarkastelemalla. Kehitettävän VP1-menetelmän herkkyyttä verrattiin diagnostiikassa käytettävään, ns. ENRI RT-menetelmään. Tuotteen laatu tarkistettiin agaroosigeelielektroforeesilla.
Työssä havaittiin merkittäviä eroja erilaisten kaupallisten tuotteiden välillä ja löydettiin VP1-geenin amplifiointiin sopivat olosuhteet. Kehitetyllä menetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 100 kopion herkkyys PCR-vaiheessa, kun
standardina käytetyllä ENRI RT-menetelmällä herkkyys oli 10 kopiota. Kvantitatiivinen RT-PCR -menetelmä testattiin kokonaisuudessaan eri virustyypeillä. Työssä analysoitiin 24 tunnettua virustyyppiä, joista neljälle ei saatu sulamislämpötilaa, mikä saattoi osin johtua myös koettimien
epäsopivuudesta. Lopputuloksena työssä kehitettiin herkkä qRT-PCRmenetelmä VP1-geeniin tuottamiseksi ja kvantitoimiseksi, mikä mahdollistaa isojen näytemäärien nopean käsittelyn ja hallinnan esimerkiksi epidemioiden
aikana. Jatkotutkimuksissa tulee testata ja määrittää menetelmän toimivuus tekemällä qRT-PCR-ajoja potilasnäytteistä.