Elongaatiotekijä alfa yhden sitoutuminen promoottorialueelle

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin Åbo Akademin biotieteiden laitoksella, professori Lea Sistosen laboratoriossa BioCityssä.

Opinnäytetyössä tutkittiin, miten solut reagoivat stressiin ja miten ne selviävät stressistä. Päähuomiona oli lämpöshokkitekijä 1:n (HSF1) ja elongaatiotekijä alfa 1:n (eEFα-1) vuorovaikutus DNA:n kanssa.Opinnäytetyössä käytettiin oligonukleotidipresipitaatio-menetelmää, jolla tietylle emäsjärjestykselle sitoutuneet proteiinit eristetään. Työ sisälsi paljon soluviljelyä, tuman eristystä, sekä proteiini-DNA -vuorovaikutusten analysointia.

Oligonukleotidipresipitaatio-menetelmällä eristettiin DNA:han sitoutunut HSF1:n solun muusta HSF-populaatiosta. Tällä menetelmällä voidaan tutkia, mitä muita proteiineja sitoutuu DNA:han HSF-perheen kanssa ja millaisessa tilassa HSF1 sitoutuu DNA:han. Tilalla tarkoitetaan sitä, että HSF1:tä säädellään liittämällä siihen eri molekyylejä, esimerkiksi fosfaattiryhmiä, joka puolestaan viestittää geeniluennan aloittamisesta. Tällä uudella tekniikalla voidaan tutkia, mitkä nämä kyseiset fosforylaatiokohdat HSF1:ssä ovat ja mitä ne viestittävät DNA:lla.

Oligonukleotidipresipitaatio-menetelmällä tutkittiin viljeltyjä ihmisen kohdunkaulansyöpäsoluja, joita lämpökäsikelttiin 42 °C:ssa puoli tuntia. Solujen keräämisen jälkeen tehtiin kokosolu- ja tumalysaatteja. Ennen varsinaista menetelmää tumat rikastettiin ja solut esipuhdistettiin. Näiden jälkeen solulysaatteihin lisättiin oligonukleotidi, jolla eristettiin DNA:n sitoutuva HSF1 sekä mahdolliset muut proteiinit.

DNA:n sitoutuneiden proteiinien analysointiin käytettiin akryyliamidigeeliä, joka erottelee proteiinit koon perusteella, sekä vasta-aineita, joilla proteiinit tunnistetaan. Pääasiassa käytetyt vasta-aineet olivat HSF1, HSF2 ja eEFα-1. Tässä opinnäytetyössä keskityttiin lämpöshokkitekijöihin ja elongaatiotekijä alfa 1:een. Tuloksien perusteella lisätutkimuksia ja testejä tarvitaan edelleen.

BINDING OF ELONGATION FACTOR ALPHA ONE TO PROMOTOR REGION

This thesis was conducted in Lea Sistonen´s laboratory in BioCity at the Department of Biosciences, Åbo Akademi University.

In this thesis it was studied how cells react to stress and how they survive under stress conditions. The main focus was on the interactions of heat shock factor 1 (HSF1) and eukaryote elongation factor alpha 1 (eEF1α-1) with DNA. In the thesis the oligonucleotide precipitation method was used, which isolates proteins that bind DNA with a specific nucleotide sequence. The work included cell culture, isolation of nuclei, and analysis of protein-DNA interactions.

In the oligonucleotide precipitation method, HSF1 that is bound to DNA is isolated from the rest of HSF population. This method can be used to examine whicht other proteins bind to the DNA together with the HSF family and how the DNA-bound HSF1 is modified. By modification small molecules are referred to, such as phosphate groups which can be attached to HSF1 and, in turn, affects the initiation of gene transcription. With this new technique the phosphorylation sites in HSF1 and the messages they mediate can be studied.

In the oligonucleotide precipitation method, human cervical cancer cells were cultured and heat shocked (42 °C) for half an hour. After collecting the cells, whole-cell lysates or nuclear lysates were made.

The isolated proteins were analyzed by SDS-PAGE and acrylamide gel Western blotting with antibodies against HSF1, HSF2 and eEFα-1. In the present study the focus was on HSF1 and eEFα-1. Based on the results further investigations and tests are needed.