AlphaLISA® TNFα immunogeenisyysmäärityksen kehitys

Abstract

Nykyään monet lääkkeet sisältävät ns. biologisia lääkeaineita, esim. vasta-aineita tai nukleiinihappoja, jotka ihmisen immuunijärjestelmä saattaa tunnistaa vieraiksi aineiksi aiheuttaen immuunipuolustusreaktion, jossa muodostuu vasta-aineita lääkemolekyyliä vastaan (anti-drug antibodies, ADA). Tällaisen lääkkeen sanotaan olevan immunogeeninen ja immunogeenisyyttä tutkitaan lääkekehityksen aikana lääkkeen turvallisuuden ja tehon osoittamiseksi. Työn päätarkoitus oli osoittaa AlphaLISA-teknologian soveltuvuus biologisten lääkeaineiden immunogeenisyyden tutkimiseen. Työssä kehitettiin menetelmä, jolla voidaan mitata TNFα vasta-aineita ihmisen seerumista. Työ tehtiin Syrinx Bioanalytics Oy:ssä yhteistyössä PerkinElmerin kanssa. AlphaLISA on homogeeninen immunomääritys, joka perustuu energiansiirtoon luovuttaja- ja vastaanottajapartikkeleiden välillä. Partikkeleiden pinnalle on konjugoitu TNFα–molekyylejä, jotka sitoutuvat näytteen sisältämien TNFα–vasta-aineiden kanssa tuoden partikkelit lähelle toisiaan. Energiansiirto on mahdollista vain, mikäli partikkelit ovat riittävän lähellä toisiaan. Homogeeninen määritys ei vaadi pesu-vaiheita, vaan kaikki inkuboinnit sekä mittaus tapahtuvat samassa liuoksessa. Työssä osoitettiin AlphaLISA–teknologian soveltuvuus immunogeenisyysmäärityksiin Ensin optimoitiin määritysparametrit, mm. partikkelien pitoisuus, inkubointiaika, näytetilavuus, ja sitten karakterisoitiin menetelmän ominaisuuksia, mm. herkkyys, toistettavuus ja lääketoleranssi. Menetelmä on toistettava ja kliinisiin määrityksiin suositeltu herkkyys saavutettiin. Menetelmän etuja ovat pieni näyte- ja reagenssikulutus ja lisäksi se on yksinkertainen ja nopea suorittaa. Todettiin, että konjugoitujen partikkelierien välillä voi olla jonkin verran vaihtelua. Suuren määrän konjugointi ei onnistunut. Vapaa lääke häiritsee määritystä, mutta happokäsittelyvaiheen lisäys paransi lääketoleranssia 5-kertaisesti. Muihin määritysformaatteihin verrattuna tällä menetelmällä arvioidaan olevan n. 10 kertaa heikompi lääketoleranssi, mikä on tämän menetelmän heikkous. Menetelmänkehitys on tehty pääosin käyttäen suoraa määritysmenetelmää, jossa molemmat partikkelit on konjugoitu suoraan TNFα:lla. Menetelmää voisi vielä verrata SA-menetelmään, jossa käytetään biotinyloitua TNFα:aa ja luovuttajapartikkelit on konjugoitu streptavidiinilla.

Many drugs today contain so called biological pharmaceuticals, e.g. anti-bodies or nucleic acids which can be recognized as foreign substances by the human immunogenicity system. This may cause an immune response where antibodies against the drug molecule are formed (anti-drug antibodies, ADA). This kind of drug is called an immunogenic and immunogenicity is studied during the development of the drug to evaluate its safety and efficiency. The aim of the study was to establish the applicability of AlphaLISA technology for the assessment of biological drug immunogenicity. A method for the detection of anti-TNFα antibodies in human serum was developed in the study. The experimental development work was performed at Syrinx Bioanalytics Oy in collaboration with PerkinElmer. AlphaLISA is a homogeneous solution phase immunoassay which is based on energy transfer between acceptor and donor beads. The surface of the beads is conjugated with TNFα molecules which are bound by anti-TNFα antibodies in the sample bringing the beads near each other. Energy transfer is possible only if the beads are close enough to each other. A homogeneous assay does not need wash steps because all incubation steps and the measurement occur in the same solution. The suitability of AlphaLISA technology for immunogenicity assessment was established. First the assay parameters were optimized (e.g. bead concentration, incubation, sample volume) and then the different properties were characterized (e.g. sensitivity, repeatability, drug tolerance). The method is reproducible and the recommended sensitivity for clinical assays was reached. The advantages of the method lie in the small consumption of sample and reagents. In addition, it is simple and fast to perform. It was observed that there may be slight variation between the conjugated bead batches. The conjugation of a larger amount of beads was unsuccessful. Free drug interferes with the assay but addition of an acid dissociation step improved the drug tolerance fivefold. Compared to other assay formats this method is estimated to have an approximately tenfold lower drug tolerance, which is the drawback of the assay. The method development was performed mainly by using a direct method where both beads are directly conjugated with TNFα. The method could also be compared to the SA method where biotinylated TNFα is used and donor beads are conjugated with streptavidin.