Perifeerisen veren mononukleaaristen valkosolujen ja RLT PLUS -LYYSAUSPUSKURIN määrän optimointi QIAGEN RNeasy® Plus Mini Kit RNA-eristysmenetelmälle

Abstract

Opinnäytetyön tarkoituksena oli optimoida perifeerisen veren mononukleaaristen valkosolujen ja RLT Plus -lyysauspuskurin määrä Qiagen RNeasy® Plus Mini Kit RNA-eristysmenetelmälle. Tehtävänä oli erotella mononukleaariset valkosolut Becton Dickinson Vacutainer® CPT™ Cell Preparation Tube with Sodium Sitrate -putkia (CPT™-putkia) käyttäen, laskea solut Bürkerin laskukammiossa, eristää ribonukleiinihappo (RNA) RNeasy® Plus Mini Kitillä sekä mitata RNA-saanto ja -puhtaus The Thermo Scientific NanoDropTM 1000 -spektrofotometrillä. Tavoitteena oli pienentää tutkimuksessa tarvittavan perifeerisen veren määrää ja vähentää CPT™-putkista aiheutuvia kustannuksia. Opinnäytetyön aihe saatiin Tampereen yliopiston Lääketieteenlaitoksen Neuroimmunologian tutkimusryhmältä, jota johtaa professori Irina Elovaara. Tutkija Sanna Rinta ja bioanalyytikko Raija Paalavuo ehdottivat aihetta Pirkanmaan ammattikorkeakoululle.

Opinnäytetyö perustui empiiriseen kokeelliseen tutkimusmenetelmään. Kokeellisen osuuden tulokset esitettiin pylväsdiagrammeina. Teoreettisessa osuudessa käsiteltiin multippeliskleroosia, mononukleaaristen valkosolujen erottelua, ribonukleaasikontaminaation ehkäisyä, RNA:n tehtäviä ja rakennetta, RNA-eristystä sekä RNA:n pitoisuus- ja puhtausmittausta.

Kokeellisen osuuden tulokset osoittavat, että suurin RNA-saanto ja -puhtaus RNeasy® Plus Mini Kitillä saadaan, kun 10 miljoonaa solua hajotetaan 600 mikrolitralla (µl) RLT Plus -lyysauspuskuria. Tulokset osoittavat myös, että kaksi miljoonaa solua on liian pieni ja 12 miljoonaa solua liian suuri solumäärä eristää RNA:ta RNeasy® Plus Mini Kitillä. Jos soluja on 7,5 miljoonaa tai vähemmän, tulee RLT Plus -lyysauspuskurin määrä kuitenkin olla 350 µl.

Optimoinnin tulokset tukivat tutkimusryhmän päätöstä vähentää RNA-eristyksessä käytettävien mononukleaaristen valkosolujen määrää. Tuloksia voitiin käyttää hyväksi myös solususpension jakamisessa ennen RNA-eristystä. Jatkotutkimuksena voisi tehdä laajemman kokeilun eri solumäärillä ja suuremmalla otoskoolla. Lisäksi polyakryyliamidigeelielektroforeesin (PAGE), agaroosigeelielektroforeesin (AGE) tai Bioanalyzer-kapillaarielektroforeesilaitteen avulla voisi tarkistaa, onko RNA pysynyt ehjänä eristyksen aikana.

The purpose of this barchelor´s thesis was to optimize the amount of mononuclear white cells in peripheral blood and RLT Plus -lysis buffer for Qiagen RNeasy® Plus Mini Kit RNA isolation method. The task was to separate mononuclear cells using Becton Dickinson Vacutainer® CPT™ Cell Preparation Tube with Sodium Sitrate blood collecting tubes, to count cells in Bürker counting chamber, to isolate ribonucleic acid using RNeasy® Plus Mini Kit and measure quantity and purity of RNA preparate using The Thermo Scientific NanoDropTM 1000 spectrophotometer. The aim was to decrease the amount of sample and expenses caused by CPT™ tubes. The subject for the barchelor’s thesis was received from University of Tampere Medical School Neuroimmunology research group led by Professor Irina Elovaara. Researcher Sanna Rinta and medical laboratory technician Raija Paalavuo suggested the subject for Pirkanmaa University of Applied Sciences.

The barchelor’s thesis was based on empirical and experimental research method. The theoretical part concerns with multiple sclerosis, cell separation, ribonuclease contamination, RNA functions, structure, isolation and quantity and purity measurement. The results of the experimental part are presented as bar charts to make the results more illustrative.

The highest quantity and purity of RNA is received when 10 million cells are degraded by 600 µl of RLT Plus -lysis buffer and RNA is isolated from the lysate using RNeasy Mini Spin -column. Doing so also the purity of the isolated RNA is highest. The results also show that two million cells is too small and 12 million cells too large cell count for isolating RNA with RNeasy® Plus Mini Kit. If the cell count is 7,5 million or less the amount of RLT Plus -lysis buffer should be 350 µl.

The results of the optimization support the research group’s decision to decrease the cell count used in RNA isolation. The results were also utilized in dividing cell suspension. A wider experiment using larger amount of samples could be made as a further study. The condition of isolated RNA could be examined with polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), agarose gel electrophoresis (AGE) or Bioanalyzer capillary electrophoresis.