DNA-eristysmenetelmän optimointi vauvojen ulostenäytteille

Abstract

Ihmisen normaalimikrobisto vaikuttaa monella tavalla terveyteen ja hyvinvointiin. Valtaosa normaalimikrobistosta sijaitsee suolistossa. Normaalimikrobiston kehitys alkaa heti lapsen synnyttyä. Normaalimikrobiston tutkimuksessa käytetään nykyään yleisesti moleekyylibiologisia analyysimenetelmiä, joita edeltää bakteeri-DNA:n eristys. Eristysmenetelmiä on monenlaisia ja aikaisempien tutkimuksien perusteella eri menetelmät antavat ristiriitaisia tuloksia, jolloin jotkin bakteerilajit ylikorostuvat ja toiset jäävät huomaamatta. Tämä opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston lääketieteellisen mikrobiologian ja immunologian laitoksella suolistomikrobiston terveysvaikutuksia tutkivassa projektissa. Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli optimoida bakteeri-DNA-eristysmenetelmä 2,5 kuukauden ikäisten vauvojen ulostenäytteille. Tavoitteena oli edistää lasten kehitystä tutkivaa FinnBrain-projektia ja kehittää Turun yliopiston suolistomikrobistoon liittyvää tutkimusta. DNA-eristysmenetelmän optimoinnilla taattiin näytteiden kelpoisuus jatkotutkimuksia varten. Työssä testattiin kolmea kaupallista kittiä yhdistettynä erilaisiin esikäsittelyihin. Kitit olivat Qiagen, GenoXtract (automaatilla) ja MoBio. Bead beating eli näytteen homogenointi helmillä testattiin kolmilla eri helmillä ja eri homogenointiohjelmilla. Korkeimmat DNA-pitoisuudet tuotti GenoXract-automaattilaitteen kitti ja lasihelmikäsittely homogenointiasetuksilla 1000rpm/3min. Eristystuotteet olivat myös riittävän puhtaita. Jatkotutkimuskelpoisuus tarkistettiin geelielektroforeesilla ja PCR-menetelmällä. Tulosten perusteella GenoXtract yhditettynä lasihelmikäsittelyyn valikoitui parhaaksi menetelmäksi.

The normal bacterial microbiota of humans affects the health and well-being of an individual many ways. The majority of the normal microbiota is in the intestines and begins to develop when a baby is born. The bacterial DNA extraction is commonly used in the research of the bacterial flora. There are numerous methods of extracting the DNA. According to previous research use of some methods return contradicting results, in which some species of bacteria are accentuated and some are completely unobserved. The research section of this thesis was performed in the Department of Clinical Microbiology and Immunology in the University of Turku. This research is part of the doctoral thesis and the project called FinnBrain. The purpose of this project was to optimize the bacterial DNA extraction method of fecal samples of 2,5 month old babies. The aim of the research was to advance a study, FinnBrain, examining development of children and to further develop the intestinal microbiota research of the University of Turku. During the research three commercial extraction kits were tested in combination with various pre-treatments. The manual extraction kits used were manufactured by Qiagen and MoBio and the automatic device tested was manufactured by GenoXtract. The bead beating, also known as homogenization, was tested with three different bead types and different homogenization methods. The automatic device GenoXtract produced the highest concentration of DNA. The best pre-treatment was homogenization with glass beads with settings 1000rpm / 3min. The extraction products were also pure enough. The products were also tested with agarose gel electrophore-sis and polymerase chain reaction –methods. Based on the results, GenoXtract automatic de-vice and bead beating with glass beads were the best method for DNA extraction.