Makrofagien polarisaation immunohistokemiallinen osoittaminen soluviljely- ja kudosnäytteistä : Menetelmän kehitys ja optimointi

Abstract

Makrofagit ovat veressä kiertävistä monosyyteistä erilaistuneita tulehdussoluja. Ne toimivat immuunipuolustuksessa fagosyytteina sekä antigeenejä esittelevinä soluina. Makrofagit tuottavat monia sytokiineja ja muita tulehduksen välittäjäaineita, ja ovat osallisina tulehdusreaktion eri vaiheissa. Eri sytokiinit ohjaavat makrofagien aktivoitumista joko klassisen tai vaihtoehtoisen aktivaation suuntaan. Klassisesti aktivoituneet makrofagit toimivat ensisijaisesti tulehdusreaktion alkuvaiheessa, kun taas vaihtoehtoisesti aktivoituneita makrofageja tavataan pääasiassa paranemassa olevassa kudoksessa sekä kroonisessa tulehduksessa.

Immunohistokemia on värjäysmenetelmä, joka perustuu antigeenin ja sille spesifisen vasta-aineen väliseen vuorovaikutukseen. Menetelmästä riippuen joko primaarivasta-aine tai sekundaarivasta-aine on leimattu tavallisimmin entsyymileimalla, joka reagoidessaan substraatin kanssa muodostaa näkyvän värin. Opinnäytetyössä värjäyksissä käytettiin LabVision Autostainer –värjäysautomaattia.

Opinnäytetyössä kehitettiin ja optimoitiin värjäysmenetelmä neljälle eri vasta-aineelle. Vasta-aine CD68 tunnisti yleisesti kudoksen makrofageja, vasta-aineet CD163 ja CD206 vaihtoehtoisesti aktivoituneita makrofageja ja vasta-aine iNOS klassisesti aktivoituneita makrofageja. Kehitetyn värjäysmenetelmän todettiin olevan toimiva ja soveltuva käyttötarkoitukseensa. Menetelmää voidaan jatkossa käyttää erilaisten solu- ja kudosnäytteiden tutkimiseen ja kehittää edelleen kaksois- ja fluoresenssivärjäyksiin soveltuvaksi.

Macrophages are inflammatory cells which differentiate from circulating monocytes to macrophages following their migration into tissues. In the immune system macrophages function as phagocytes and antigen-presenting cells and they produce various cytokines and other mediators which direct and regulate the inflammatory response. Depending on the inflammatory and tissue environment, macrophages display different phenotypes with distinct functional properties. Cytokines produced by T lymphocytes guide the polarization of macrophages towards either classical (M1) or alternative (M2) activation. Classically activated macrophages are important effector cells in acute inflammation, while alternatively activated macrophages are found in recovering tissue and in chronic inflammation.

Immunohistochemistry is a staining technique based on specific antigen-antibody interaction. Binding of the antibody to its antigen is detected either by direct labeling of the antibody, or by the use of a secondary labeling method. Most widely used labels in immunohistochemistry are enzymes. When the labeling enzyme reacts with a proper substrate, it forms a visible precipitate. In the present study, immunohistochemical staining was carried out by using a LabVision Autostainer device.

In the present thesis an immunohistochemical staining technique was developed and optimized to detect M1 and M2 macrophage phenotypes by using four different antibodies. CD68 antibody was used as a common macrophage antibody to detect all macrophage phenotypes. CD163 and CD206 antibodies identified alternatively activated macrophages and iNOS antibody was used to determine classically activated macro-phages. The staining method was shown to be appropriate and suitable for the purpose of staining cell culture and tissue samples.