Testing fungal DNA on ligation detection reaction microarray

Abstract

The aim of this thesis was to test how LDR (Ligation Detection Reaction) microarrays could detect fungal DNA isolated from pure cultures. The DNA probes for fungal detection had been tested before by polyacryl amide gel electrophoresis (PAGE), but in this study they were tested on the microarray for the first time. This project was part of the project YMLI A30175 funded by EU Regional Fund and aiming for example to further develop DNA microarrays as a product and service for environmental analysis.

The practical part of the thesis project consisted of three steps. First, the templates were prepared for LDR testing by polymerase chain reaction (PCR) amplification of the fungal nuclear ribosomal internal transcribed spacers (ITSs) region and to ensure by agarose gel electrophoresis that the PCR has been successful. In the second step, the probes (altogether 24 common and discriminating probes) were ligated together with the PCR product and then hybridized to LDR array. The fluorescent levels of the hybridized microarray spots were read with a scanner. In the third step the data was analyzed using Bioconductor, which is open source software.

Seven of the tested probes worked well on microarray. Two of the probes were classified as faintly working on microarray, because only one of their two samples gave faint or positive signal. From the 15 probes that gave negative result, 4 probes had already shown unclear results on PAGE gel or had not been tested before. One of negative probes was found to have errors in their sequence. Also, the quality of the used samples might have influenced the results.

The results of this thesis show that some of the probes did not work properly on microarray, but however some of the probes gave positive result. To confirm that the probes are not working, more testing would be needed.

Tämän opinnäytteen tavoitteena oli testata kuinka hyvin LDR- mikrosiru (Ligation Detection Reaction) kykenee havaitsemaan sienilajien puhdasviljelmästä eristettyä DNA:ta. Opinnäytteessä käytettyjä koettimia oli testattu aikaisemmin vain polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE), mutta tässä työssä näitä koettimia testattiin ensimmäistä kertaa mikrosirulla. Opinnäyte oli osana YMLI A30175 -projektia, joka on rahoitettu EU:n aluekehitysrahastosta.

Opinnäyte koostui kolmesta vaiheesta. Ensimmäisessä vaiheessa LDR sirujen testauksessa käytettävät DNA-templaatit, jotka koostuivat sienten ribosomaalisen DNA:n välialueista (ITS-alue), monistettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla. PCR-tuotteiden laatu varmistettiin elektroforeesigeelillä. Toinen vaihe koostui ligaatiosta ja hybridisaatiosta. Ligaatiossa PCR-tuotteet ja alukeparit liitettiin yhteen ligaatioreaktion avulla. Hybridisaatiossa ligaatiotuotteet hybridisoitiin mikrosirun pinnalla olevien alukkeiden kanssa ja syntyneet fluoresenssitasot mitattiin skannerilla. Kolmannessa vaiheessa tuloksia analysoitiin käyttämällä Bioconductor-ohjelmaa.

Opinnäytteessä testatuista 24 alukeparista 7 antoi selkeästi positiivisen tuloksen. Kaksi alukepareista voitiin luokitella toimivan heikosti, koska vain toinen alukkeiden templaateista antoi heikosti tai vahvasti positiivisen tuloksen. Viisitoista aluketta antoivat negatiivisen tuloksen. Näistä neljä oli antanut aikaisemmin negatiivisen tai epäselvän tuloksen PAGE-geelillä tai niitä ei ollut aikaisemmin testattu. Lisäksi yhden alukkeen sekvenssissä huomattiin virheitä. Käytettyjen näytteiden konsentraatio oli alhainen ja saattoi osaltaan vaikuttaa tuloksiin.

Tulokset osoittivat, että vaikka osa käytetyistä koettimista ei toiminut, osa kuitenkin antoi positiivisen tuloksen sirulla. Huonosti toimineet alukkeet tarvitsivat enemmän kokeita, jotta saataisiin varmuus niiden toiminnasta.