Uuden seulontamenetelmän kehittäminen rekombinanttivasta-aineille

Abstract

Tämä opinnäytetyö tehtiin VTT:n immunodiagnostiikan työryhmässä, ja sen tavoitteena oli uuden seulontamenetelmän kehittäminen rekombinanttivasta-aineille.

Mallivasta-aineena tutkimuksessa käytettiin testosteronin ja sitä tunnistavan primäärisen vasta-aineen muodostamaa immunokompleksia tunnistavaa single chain variable fragment-alkaalista fosfataasi-fuusioproteiinia (scFv-AP). scFv-AP:tä koodaava synteettinen geeni transformoitiin Escherichia coli -bakteerisoluihin. Fuusioproteiinin toimivuus testattiin ELISA- ja immunoblot -menetelmillä, minkä jälkeen siirryttiin käyttämään aiemmasta kirjastoseulonnasta saatuja vasta-ainegeenipooleja.

Geenipoolit transformoitiin E. coli -soluihin ja niiden tuottotasoja tarkasteltiin ELISAlla. Poolit seulottiin yksittäispesäkkeinä VTT:n robottiasemalla, jolloin löydettiin 20 positiivista kloonia. Näiden kloonien plasmidi-DNA lähetettiin sekvensoitavaksi. Niille tehtiin myös tuottotasomääritykset Western blotilla, ELISAlla sekä alkaalisen fosfataasin entsyymiaktiivisuutta mittaamalla, minkä pohjalta valittiin kaksi kloonia suuren mittakaavan vasta-ainetuottoon.

Tuotetut vasta-aineet puhdistettiin IMAC-menetelmällä, minkä jälkeen niitä voitiin hyödyntää ELISA-pohjaisen immunokompleksimenetelmän kehityksessä. Puhdistetuilla vasta-aineilla optimoitiin ELISA-testiformaattia testaamalla eritasoisia vasta-aine- ja testosteronipitoisuuksia, sekä eri bakteerikasvatusmediumeja.

Tutkittua scFv-AP-fuusioproteiinia pystyttiin tuottamaan bakteerisoluissa, ja se kykeni tunnistamaan anti-tes-vasta-aineen ja testosteronin muodostaman immunokompleksin. Sen proteiinituottotasot jäivät kuitenkin vielä melko mataliksi.

Kehitetty ELISA-määritysmenetelmä vaikuttaa toimivalta, mutta sitä olisi vielä kokeiltava eri olosuhteissa, jotta voitaisiin varmistua sen yleispätevyydestä.

This thesis was carried out in the immunodiagnostics research team at VTT Technical Re-search Center of Finland. The purpose of the thesis project was the development of a new screening method for recombinant antibodies.

The model antibody used in this thesis project was a fusion protein consisting of a single chain variable fragment attached to an alkaline phosphatase enzyme (scFv-AP), which recognizes an immune complex formed by testosterone bound to a primary antibody. The synthetic gene which codes the fusion protein was transformed into Escherichia coli bacte-rial cells. After the functionality of the fusion protein was confirmed by ELISA and im-munoblotting tests, the rest of the thesis project was carried out with antibody gene pools from an earlier library screening.

The gene pools were transformed into E. coli cells, and their antibody yields were meas-ured by ELISA. The pools were screened with VTT’s robotic screening station, and 20 pos-itive clones were found. The plasmid DNA of the positive clones was extracted, and sam-ples were sent to Gatc Biotech for sequencing. The antibody yields of the clones were de-termined by ELISA, immunoblotting and by enzyme activity measurements of the alkaline phosphatase. On the basis these tests, two clones were selected for larger scale fusion protein production.

The produced fusion proteins were purified with IMAC, after which they were utilized in the development of an ELISA-based immune complex assay. The assay method was opti-mized by testing different antibody and testosterone levels as well as by using different bacterial growth mediums.

The studied scFv-AP fusion protein could be produced in bacterial cells, and it was capable of identifying antibody-testosterone immune complex. Its protein yields were, however, still quite low. The developed ELISA-assay appears to be working, but it would still be prudent to test it in different conditions to determine its general validity.