PT-Moduli immunohistokemiallisten näytteiden esikäsittelyssä

Abstract

Moderni patologia hyödyntää immunohistokemiaa kasvainten tunnistamisessa ja luokittelussa. Solutasolla tapahtuvissa reaktioissa pystytään osoittamaan yksittäisiä antigeeneja, joiden esiintyminen voi vaikuttaa hoidon suunnitteluun. Immunohistokemialliset värjäykset perustuvat vasta-aineiden kykyyn sitoutua spesifisesti omaan antigeeniinsa. Muodostuneet vasta-aine-antigeeni-kompleksit pystytään osoittamaan erilaisilla leimausmenetelmillä ja väriaineilla, eli kromogeeneilla. Tässä työssä käytetyn immunohistokemiallisen värjäyksen detektio perustuu piparjuuren peroksidaasientsyymin ja 3,3’diaminobentsidiinin reaktiossa syntyvään ruskeaan väriin.

PT-Moduli on immunohistokemiallisten näytteiden esikäsittelyyn tarkoitettu laite, jolla pystytään palauttamaan formaliinifiksaation aikana kudoskappaleiden ja solujen pinnalla tapahtuneita muutoksia. Muutosten palauttaminen (antigen retrieval) on immunohistokemiallisen värjäyksen onnistumisen kannalta tärkeää, koska formaliinifiksaation aikana kudosrakenteisiin syntyneet metyleenisillat heikentävät kudosten antigeenisyyttä merkittävästi. Korkean lämpötilan esikäsittelyn aikana kudosleikkeet kuumennetaan sopivassa puskuriliuoksessa lähelle kiehumispistettä.

Tämän opinnäytetyön tarkoitus on kokeilla voidaanko PT-Modulia käyttää immunohistokemiallisten näytteiden esikäsittelyssä mikroaaltouunin rinnalla. Keski-Suomen keskussairaalan patologian yksikössä immunohistokemiallisten näytteiden esikäsittelyt on optimoitu laboratoriokäyttöön soveltuvalle mikroaaltouunille. Mikroaaltouunissa voidaan tehdä vain yksi esikäsittely kerrallaan, kun PT-Moduli puolestaan tarjoaa mahdollisuuden kahteen samanaikaiseen esikäsittelyyn. Verrattaessa PT-Modulia mikroaaltouunitekniikkaan skotlantilainen tutkimusryhmä on osoittanut PT-Modulin käytön eduiksi esikäsittelyn nopeutumisen, vähäisemmät vahingot kudosleikkeille esikäsittelyn aikana ja mahdollisuuden käyttää suurempia vasta-ainelaimennoksia.

Työn tuloksena PT-Modulin havaittiin soveltuvan immunohistokemiallisten näytteiden esikäsittelyyn vasta-ainekohtaisten optimointien jälkeen. Osa kokeilluista 61 vasta-aineesta antoi hyviä värjäystuloksia käytetyissä esikäsittelyolosuhteissa, mutta suurin osa vaatii optimointia esikäsittelyajan ja vasta-ainelaimennoksen osalta.

Modern pathology utilizes immunohistochemistry in the identification and classification of tumours. The immunohistochemical demonstration of cellular antigens may influence on treatment decisions. Immunohistochemical staining is based on the ability of antibodies to react with their respective specific antigens. Antibody-antigen-complexes can be detected by various labelling methods and staining substances, i.e. chromogens. The detection method used in this bachelor’s thesis is based on the reaction between the horseradish peroxidase-enzyme and 3.3’diaminobezidine forming a brown pigment.

A PT-Module is a laboratory device designed for the pre-treatment of immunohisto-chemical samples. The device can retrieve the changes on the tissues and cell surfaces caused by formalin fixation. This process is called antigen retrieval. Successful antigen retrieval has a significant impact on staining results: methylene bridges formed during formalin fixation decrease the antigenic properties of a tissue considerably. Tissue sections are heated near the boiling point in an aqueous buffer solution when using high temperature antigen retrieval techniques.

The objective of this bachelor’s thesis was to test the PT-Module’s suitability for anti-gen retrieval in comparison with the microwave oven – based techniques. Immuno-histochemical staining methods have been optimized for a laboratory grade microwave oven in the Pathology Department of Central Finland Health Care District. Microwave oven is suitable for only one pre-treatment at a time, whereas a PT-Module provides an option to carry out two pre-treatments simultaneously. A Scottish research group compared the microwave oven methods with the PT-Module and discovered that the PT-Module had certain advantages. Their study showed that the use of a PT-Module shortened the pre-treatment time, decreased the mechanical damage of tissue sections and allowed more dilution of the antibodies.

The present bachelor’s thesis showed that a PT-Module suits well for antigen retrieval after further optimization. Some of the 61 antibodies used in this study showed good staining results, but most of the antibodies required additional modifications of the pre-treatment time and dilution of the antibody.