Pan-enterovirusvasta-aineiden testaaminen immunofluoresenssimenetelmällä

Abstract

Opinnäytetyössä tutkittiin kaupallisten enterovirusvasta-aineiden toimivuutta ja kykyä tunnistaa tietty pikornavirustyyppi soluviljelmissä immunofluoresenssimenetelmällä (IF-menetelmä). Koska pikornavirukset ovat sekvensseiltään ja siten myös pintarakenteiltaan erilaisia, tiettyä virusta vastaan tuotetut vasta-aineet eivät välttämättä tunnista muita virustyyppejä. Tällöin vasta-aineisiin perustuvan laaja-alaisesti tunnistavan ns. antigeeninosoitustestin kehittäminen on haastavaa. Työssä käytettiin ns. pan-enterovirusvasta-aineita, joiden pitäisi tunnistaa eri pikornavirustyyppejä eli ne eivät ole spesifisiä yhdelle virustyypille.

Pikornavirukset (mm. entero- ja parechovirukset) ovat hyvin pieniä vaipattomia RNA-viruksia. Nämä virukset ovat yleisimpiä ihmisen taudinaiheuttajia. Turun Virusopin viruskokoelmista on valikoitu n. 50 pikornavirustyyppikantaa käsittäen entero- ja parechoviruksia, jotka infektoitiin valikoituihin solulinjoihin. Virusinfektiota seurattiin sytopaattisen vaikutuksen perusteella valomikroskoopilla. Infektoituvuuden perusteella sopivimmat virukset valittiin lisäykseen ja vasta-ainekokeisiin. Työssä testattiin useita kirjallisuudessa mainittuja solulinjoja kuten RD, A549, B-vero, HT29 ja MRC5 ja näistä valittiin kullekin virustyypille sopivin solulinja. Työssä testattiin Meridian Monoclonal Ab EV5 to Enterovirus, Meridian Monoclonal Ab to Enterovirus VP1 ja Dako 5-D8/1 Monoclonal Mouse Anti-Enterovirus pan-enterovirusvasta-aineita pikornavirusten tunnistamiseksi infektoiduista soluista. Työ tehtiin infektoimalla soluja ja fiksoimalla solut ennen vasta-ainevärjäystä. Kuvantamiseen käytettiin Turun yliopiston kuvantamiskeskuksen (Turku BioImaging) AxioVert 200M mikroskooppi.

Tulokset osoittivat, että Meridian EV5 ja VP1 vasta-aineiden tunnistusprofiili on laajempi kuin Dako vasta-aineen. Vasta-aine Meridian EV5 tunnisti coxsackievirus B1-5 -virustyyppejä, ja echovirus E-2,-12,-13,-16,-17,-20 -virustyyppejä. Meridian VP1 tunnisti samat virustyypit ja lisäksi coxsackievirus A13-virustyyppiä. Dako tunnisti edelleen coxsackievirus B1-5 virustyyppejä ja echovirus E-9,-12,-16 ja -17 virustyyppejä. Vasta-ainekokeiden aikana havaittiin että MRC5-soluilla käytetyt pikornavirusvasta-aineet Meridian EV5 ja Meridian VP1 antoivat mikroskoopilla vihreän taustan, minkä takia virukset ja vasta-aineet tarkistettiin A549- ja RD-soluilla. Työn tuloksia voidaan soveltuvin osin käyttää pikornavirusdiagnostiikassa esim. kehitettäessä antigeeninosoitustestiä.

The purpose of this thesis was to test the ability of commercially available pan-enterovirus antibodies to detect different Pikornavirus types in cell lines by immunofluorescence assay (IFA). Picornaviruses (enteroviruses and parechoviruses) are small, non-enveloped, positive-stranded RNA viruses. They are the most common human pathogens, which cause diseases like respiratory tract illnesses, hand, foot, and mouth disease, aseptic meningitis and other infections. Selected entero- and parechoviruses were grown in different cell lines including RD, A549, MRC5 and HT29. Infectivity of viruses (measured as formation of cytopathic effect (CPE) in cell cultures) was determined before IFA using a light microscope. The following pan-entero antibodies were used: Meridian Monoclonal Antibody EV5 to Enterovirus, Meridian Monoclonal Antibody to Enterovirus VP1 and Dako 5-D8/1 Monoclonal Mouse Anti-Enterovirus. Antibody Meridian EV5 detected coxsackievirus B1-5 serotypes, and echovirus E-2,-12,-13,-16,-17,-20 –serotypes and antibody Meridian VP1 detected the same serotypes and also coxsackievirus A13 while antibody Dako 5-D8/1 detected coxsackievirus B1-5 and echovirus E-9,-12,-16 and -17 serotypes. There was also significant background staining when antibodies Meridian EV5 and VP1 were used in MRC5 cell line. In all, the pan-enterovirus antibodies detected coxsackievirus B1-5 and echovirus E-12,-16 and -17 serotypes. None of the antibodies gave positive result against human rhinoviruses or parechoviruses. In pan-enterovirus antibodies are to be used in other assay formats, the performance must be empirically determined for false positivity due to background staining. The work was carried out in the Department of Virology, University of Turku in AIROPico project.