PIK3CA-mutaatioanalyysi syöpädiagnostiikan avuksi

Abstract

Syöpä on geneettinen sairaus, minkä vuoksi syöpäkasvaimen geneettisten muutosten tunteminen auttaa kohdennettujen täsmälääkkeiden valinnassa ja hoitovasteen arvioinnissa. Tämän työn tarkoituksena oli kehittää PIK3CA-geenin mutaatioanalyysi syöpädiagnostiikkaan soveltuvaksi. PIK3CA on PI3K/Akt/mTOR-reaktiotiellä keskeisenä tekijänä olevan PI3K-proteiinin katalyyttinen osa. PIK3CA-geenin mutaatiot moninkertaistavat PI3K:n aktiivisuuden, jolloin reitin signalointi ei ole enää riippuvainen reseptoriin sitoutuvasta kasvutekijästä. Reitti säätelee keskeisiä solun toimintoja, kuten jakautumista ja erilaistumista, ja on yksi useimmin mutatoituneista reaktioreiteistä syövässä.

Kehitettävänä olleessa menetelmässä näytteenä on potilaan parafiiniin valetusta kudosnäytteestä eristetty DNA. DNA:sta monistetaan PCR:llä yleisimmin mutaatioita sisältä-vät kohdat. PIK3CA-geenin somaattisista pistemutaatioista yli 80% sijaitsee eksonin 9 kodoneissa 542 ja 545 ja eksonin 20 kodonissa 1047. Jaksojen monistamisen jälkeen PCR-tuote sekvensoidaan pyrosekvensointimenetelmällä.

Menetelmän suurimpina haasteina olivat pseudogeenin monistuminen ja kontaminaatioherkkyys. Näihin haasteisiin pyrittiin vastaamaan PCR-alukkeita, olosuhteita ja työtapoja muokkaamalla. Työssä löydettiin PCR-alukkeet, joilla PCR-olosuhteita tiukentamalla päästiin eroon pseudogeenin monistumisesta. Kontaminaatio-ongelmasta PCR:ssä ei päästy kokonaan eroon, mutta huolellisilla työtavoilla kontaminaatio pysyi vähäisenä eikä häirinnyt varsinaisten näytteiden tulosten tulkintaa. Menetelmän herkkyys ja toistettavuus määritettiin mutaatioita sisältävistä standardi-DNA-näytteistä tehdyillä laimen-nossarjoilla. Menetelmä osoittautui hyvin herkäksi ja toistettavuus oli hyvä. Menetelmä löysi luotettavasti myös tiedossa olleet mutaatiot tutkituista rintasyöpänäytteistä.

Menetelmästä tuli tämän opinnäytetyön myötä käyttökelpoinen ja sitä voidaan jatkossa käyttää Keski-Suomen keskussairaalan patologian osastolla tutkimusnäytteiden analy-sointiin.

Cancer is a genetic disease. Therefore, the knowledge of genetic changes in a tumor helps clinicians to tailor the treatment of a patient and predict the clinical response. The purpose of this Bachelor's thesis was to improve the mutation analysis of the PIK3CA-gene for a reliable detection of the most common mutations in the gene.

The PI3K/Akt/mTOR-pathway is among the most frequently mutated pathways in hu-man cancer. This pathway regulates several cellular processes, such as cell growth, pro-liferation and differentiation. PIK3CA is the catalytic subunit of PI3K protein, and the mutations in PIK3CA-gene multiply the activity of PI3K. This leads to a constitutive activation of the pathway regardless of the growth factor binding into the cell-surface receptor.

In the current method, the sample DNA is first extracted from a tissue sample embedded in paraffin. DNA samples are amplified by using PCR for regions including the most common mutations. These are codons 542 and 545 in exon 9 and codon 1047 in exon 20. These mutations cover ~80% of the somatic point mutations found in the PIK3CA-gene. After amplification, a mutation analysis is performed by using pyrosequencing.

The two main challenges in this study were to avoid the pseudogene amplification and to prevent contamination in the PCR reactions. For this purpose, the PCR primers, PCR conditions and the related work operations were modified. Suitable PCR primers were found which together with adjusted PCR conditions excluded the pseudogene amplification. However, the problems with PCR contamination were not totally solved. Fortunately, the level of contamination was sufficiently low to allow the mutation analysis of patient samples. The sensitivity and reproducibility of the method were determined by using dilutions of the reference mutation standards. The method proved to be very sensitive and reproducible. Known mutations were reliably found in previously studied breast cancer samples.

The Bachelor's thesis produced a usable method for mutation analysis of PIK3CA. The method can be further used in the Pathology Laboratory of the Central Finland Central Hospital for testing the most common mutations in PIK3CA-gene from patients with cancer.