Histone Acetyltransferase Complexes - expression and purification of ATAC HAT

Abstract

The Bachelor’s thesis project was conducted to gather new information about a histone acetyltransferase (HAT) complex named Ada-Two-A-Containing complex (ATAC). It is a transcriptional activator that modifies the chromatin structure so that it is more available for transcription. The purpose for the work was to produce and purify the HAT module of ATAC as a prerequisite for structural analysis of ATAC HAT nucleosome complexes by native mass-spectrometry. The laboratory work was done at the European Molecular Biology Laboratory outstation in Grenoble; France, as a part of Berger group’s research. The project consists of two main sections: the expression of the three modifications of ATAC HAT protein complexes in insect cells and the purification of these complexes by immobilized metal affinity chromatography and size exclusion chromatography. The steps realised in the laboratory include a great variety of different techniques such as SDS-page, agarose gel electrophoresis, Western blotting, microscoping and fluorescence measurements. The results obtained show that these three complexes are well producible in insect cells and the purification procedure works as it is. Nevertheless, some modifications could be made for the amounts of cultures prepared. The project provides a full protocol for the production of ATAC HAT complexes in a laboratory. The concrete results of the project are the viruses, plasmids and protein ready to use in the next steps of the scientific research. Nevertheless, the final amount of protein was less than 0.5 mg per protein which remains quite low.

Opinnäytetyön aiheena oleva proteiinikompleksi Ada-Two-A-Containing Histone Acetyltransferase, lyhyemmin ATAC HAT, vaikuttaa solun nukleosomissa DNA-juosteen transkription aktiivisuuteen. Kompleksi muokkaa juosteen rakennetta ja pakkautumista niin, että DNA-polymeraasit voivat toimia vapaammin. ATAC HAT kompleksin rakenne ei ole vielä tarkasti selvillä, joten projektin tarkoituksena oli tuottaa ja puhdistaa kyseistä proteiinia myöhempää massaspektrometrista tutkimusta varten. Työ toteutettiin Euroopan Molekyylibiologian laboratorion (EMBL), Grenoblen yksikössä Ranskassa, osana Bergerin tutkimusryhmän projektia. Opinnäytetyö jakaantuu kahteen suurempaan osaan. Ensimmäinen on kolmen eri ATAC HAT modifikaation tuottaminen hyönteissoluissa, ja toinen kyseisten proteiinien puhdistaminen käyttämällä affiniteettiin ja kokoon perustuvia kromatografisia tekniikoita. Proteiinin tuottaminen oli valmiin protokollan avulla yksinkertaista ja toimivaa niin ekspression kuin puhdistamisenkin osalta. Soluviljelmän kokoa tosin voisi kasvattaa, jotta proteiinia jäisi enemmän jäljelle kaikkien puhdistusvaiheiden jälkeen. Työn tuloksena jokaista proteiinia saatiin alle 0,5 mg, joten saanto on melko alhainen. Projektin ansiosta saatiin kuitenkin tarvittavat plasmidit ja virukset ATAC HAT kompleksien tuottamiseksi sekä hieman proteiinia tuleviin tutkimuksiin. Lisäksi opinnäytetyö tarjoaa kokonaisvaltaisen protokollan kyseisten proteiinien valmistukseen alusta loppuun.