Solunäytteiden laaduntarkkailun kehitystyö
Virtanen, Olli (2017)
Virtanen, Olli
Tampereen ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017100515777
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017100515777
Tiivistelmä
Opinnäytetyö suoritettiin THL Biopankin DNA-näytehallintalaboratoriossa Helsingissä. Sinne varastoidaan eri puolilta Suomea biologisia näytteitä myöhempiä tutkimuksia varten. Usein yhdestä henkilöstä on useampia näytteitä puhtaana DNA:na tai soluina. Laboratorion sisäiseen laaduntarkkailuun kuuluu samasta henkilöstä lähtöisin olevien näytteiden tunnistaminen geenimerkkien ja PCR-menetelmien avulla.
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää laboratorion sisäistä laaduntarkkailua. Tarkoituksena oli kehittää solunäytehallinnan käyttöön soveltuva laaduntarkkailumenetelmä. Sukupuolen määrittävää SEX-PCR-menetelmää on käytetty karkeaan laatukontrolliin, mutta sen antamat tulokset eivät ole olleet yhtenäisesti luotettavia. Menetelmän toimivuutta pyrittiin parantamaan työstämällä PCR-reaktiota ja vertailemalla erilaisia tapoja eristää DNA:ta. Tarkemmassa kontrollissa on käytetty kuuteen geenimerkkiin perustuvaa ID-PCR-menetelmää, mutta sen tulokset on analysoitu FIMM:n laboratoriossa. Menetelmän korvaamisen toivossa testattiin uutta PCR-menetelmää, jossa yksilötunnistukseen käytetään D1S80-minisatelliittia. Minisatelliittia käytettiin tunnistamaan sisäistä virhettä eli eristämisen aikana tapahtuvaa näytteiden sekaantumista. ID-PCR-menetelmää käytettiin testaamaan kahdesta eri näyteryhmästä ulkoista virhettä eli näytteiden kesken tapahtuvaa sekaantumista ennen biopankkiin saapumista. Kaikki DNA-näytteet eristettiin hepariinia sisältävistä veri- ja solunäytteistä. Koska hepariini inhiboi PCR-reaktioita, pyrittiin löytämään parhaiten inhibointia vähentävä eristysmenetelmä.
Vaihtamalla SEX-PCR-menetelmän ohjelma ja muuntelemalla komponentteja tai niiden pitoisuuksia menetelmästä tehtiin huomattavasti varmempi. D1S80-minisatelliitin monistamiskokeessa alle 40 %:lla näytteistä saatiin näkyviä tuloksia. Näytteiden erottavuus ei kuitenkaan riittänyt sisäisen virheen luotettavaan arviointiin. ID-PCR-tekniikkaa käyttämällä ei löytynyt ulkoista virhettä pienestä näyteryhmästä, joka testattiin. DNA:n eristäminen voitiin tehdä manuaalisesti tai kalliimmalla kaupallisella eristyskitillä, tosin jälkimmäisellä hepariini-inhiboinnin vähentyminen oli todennäköisempää.
Tavoite ja tarkoitus ovat toteutuneet SEX-PCR-menetelmän osalta. D1S80-minisatelliitti on yksinään osoittautunut riittämättömäksi sisäisen virheen tarkkailuun. Mikäli ID-PCR halutaan korvata, uuteen PCR-menetelmään on vähintään lisättävä toinen geenimerkki. Kaikkien tulosten perusteella hepariinin inhiboiva vaikutus riippuu näyteryhmästä ja vähenee todennäköisimmin kaupallista eristyskittiä käyttämällä. Mikäli halutaan käyttää halvempaa manuaalieristystä, menetelmää on vielä kehitettävä, että inhibointi vähentyisi ryhmästä riippumatta.
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää laboratorion sisäistä laaduntarkkailua. Tarkoituksena oli kehittää solunäytehallinnan käyttöön soveltuva laaduntarkkailumenetelmä. Sukupuolen määrittävää SEX-PCR-menetelmää on käytetty karkeaan laatukontrolliin, mutta sen antamat tulokset eivät ole olleet yhtenäisesti luotettavia. Menetelmän toimivuutta pyrittiin parantamaan työstämällä PCR-reaktiota ja vertailemalla erilaisia tapoja eristää DNA:ta. Tarkemmassa kontrollissa on käytetty kuuteen geenimerkkiin perustuvaa ID-PCR-menetelmää, mutta sen tulokset on analysoitu FIMM:n laboratoriossa. Menetelmän korvaamisen toivossa testattiin uutta PCR-menetelmää, jossa yksilötunnistukseen käytetään D1S80-minisatelliittia. Minisatelliittia käytettiin tunnistamaan sisäistä virhettä eli eristämisen aikana tapahtuvaa näytteiden sekaantumista. ID-PCR-menetelmää käytettiin testaamaan kahdesta eri näyteryhmästä ulkoista virhettä eli näytteiden kesken tapahtuvaa sekaantumista ennen biopankkiin saapumista. Kaikki DNA-näytteet eristettiin hepariinia sisältävistä veri- ja solunäytteistä. Koska hepariini inhiboi PCR-reaktioita, pyrittiin löytämään parhaiten inhibointia vähentävä eristysmenetelmä.
Vaihtamalla SEX-PCR-menetelmän ohjelma ja muuntelemalla komponentteja tai niiden pitoisuuksia menetelmästä tehtiin huomattavasti varmempi. D1S80-minisatelliitin monistamiskokeessa alle 40 %:lla näytteistä saatiin näkyviä tuloksia. Näytteiden erottavuus ei kuitenkaan riittänyt sisäisen virheen luotettavaan arviointiin. ID-PCR-tekniikkaa käyttämällä ei löytynyt ulkoista virhettä pienestä näyteryhmästä, joka testattiin. DNA:n eristäminen voitiin tehdä manuaalisesti tai kalliimmalla kaupallisella eristyskitillä, tosin jälkimmäisellä hepariini-inhiboinnin vähentyminen oli todennäköisempää.
Tavoite ja tarkoitus ovat toteutuneet SEX-PCR-menetelmän osalta. D1S80-minisatelliitti on yksinään osoittautunut riittämättömäksi sisäisen virheen tarkkailuun. Mikäli ID-PCR halutaan korvata, uuteen PCR-menetelmään on vähintään lisättävä toinen geenimerkki. Kaikkien tulosten perusteella hepariinin inhiboiva vaikutus riippuu näyteryhmästä ja vähenee todennäköisimmin kaupallista eristyskittiä käyttämällä. Mikäli halutaan käyttää halvempaa manuaalieristystä, menetelmää on vielä kehitettävä, että inhibointi vähentyisi ryhmästä riippumatta.