The Overexpression, Purification and Characterization of FhuA, pb5 and VHH Antibodies, and Complex Formation for Crystallization Screening
Mikkola, Emmi (2017)
Mikkola, Emmi
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2017
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017112818507
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2017112818507
Tiivistelmä
Membraaniproteiinit mahdollistavat tarvittavan viestinnän solun ja sen ympäristön välillä, jonka vuoksi ne voivat toimia muun muassa kuljettajaproteiineina. Niitä voi kuitenkin käyttää hyväkseen myös erilaiset patogeenit infektioprosesseissaan, kuten bakteriofaagit, joista eräänä myös T5.Se käyttää reseptoriin sitoutuvaa spesifistä proteiiniaan E.colin infektoimiseen, käyttäen bakteerin kuljettajaproteiinia solun kiinnittymiseen ja tunnistamiseen.
Kyseisessä tutkimuksessa keskityttiin kahteen proteiiniin, tarkoituksena proteiinikompleksin tutkiminen, muodostuen a) E. colin ferrikromikuljettajaproteiini “FhuA:sta”, esiintyen bakteerin solukalvolla ja b) bakteriofaagin häntäproteiinin ”pb5:stä”: Myös VHH antibodeja käytettiin FhuA:n ja pb5:n kristallisoimisen optimoimiseksi, joiden tarkoituksena oli lisätä kompleksin liukoisuutta. Tekniikkoina käytettiin ekspressiota E.coli -soluissa ja erilaisia kromatografisia puhdistusmenetelmiä, jonka jälkeen kristallisaatio suoritettiin, joko käsin pipetoimalla, tai ulkoisen HTX laboratorion avulla.
Tuloksena saavutettiin usean työvaiheen optimointi, lisäinformaation saavuttaminen proteiinien käsittelystä, sekä usean kristallin muodostuminen, joita voidaan jatkossa käyttää röntgensädekristallografiassa, jos niiden laatu täyttää vaatimukset. Tällöin voitaisiin saavuttaa FhuA-pb5 proteiinikompleksin kolmiulotteinen rakenne, mikä avaisi faagin infektioprosessia ja vuorovaikutusta kuljettajaproteiinin kanssa.
Projekti suoritettiin Grenoblessa, Ranskassa, IBS -tutkimuskeskuksessa (Institut Biologie Structurale), tutkimusryhmässä nimeltä Membraanit ja Patogeenit (M&P).
Kyseisessä tutkimuksessa keskityttiin kahteen proteiiniin, tarkoituksena proteiinikompleksin tutkiminen, muodostuen a) E. colin ferrikromikuljettajaproteiini “FhuA:sta”, esiintyen bakteerin solukalvolla ja b) bakteriofaagin häntäproteiinin ”pb5:stä”: Myös VHH antibodeja käytettiin FhuA:n ja pb5:n kristallisoimisen optimoimiseksi, joiden tarkoituksena oli lisätä kompleksin liukoisuutta. Tekniikkoina käytettiin ekspressiota E.coli -soluissa ja erilaisia kromatografisia puhdistusmenetelmiä, jonka jälkeen kristallisaatio suoritettiin, joko käsin pipetoimalla, tai ulkoisen HTX laboratorion avulla.
Tuloksena saavutettiin usean työvaiheen optimointi, lisäinformaation saavuttaminen proteiinien käsittelystä, sekä usean kristallin muodostuminen, joita voidaan jatkossa käyttää röntgensädekristallografiassa, jos niiden laatu täyttää vaatimukset. Tällöin voitaisiin saavuttaa FhuA-pb5 proteiinikompleksin kolmiulotteinen rakenne, mikä avaisi faagin infektioprosessia ja vuorovaikutusta kuljettajaproteiinin kanssa.
Projekti suoritettiin Grenoblessa, Ranskassa, IBS -tutkimuskeskuksessa (Institut Biologie Structurale), tutkimusryhmässä nimeltä Membraanit ja Patogeenit (M&P).