Optimizing the Bacterial Expression and Purification of Phactr4 Protein and its Fragments
Gaynor, Sarah (2010)
Gaynor, Sarah
Metropolia Ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201005088426
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201005088426
Tiivistelmä
Tämä opinnäytetyö tehtiin Maria Vartiaisen tutkimusryhmälle Biotekniikan Instituuttiin. Työn tavoitteina olivat: 1. Optimoida Phactr4 proteiinin fragmentti Ph4 1-528 kloonaus pET41a vektoriin, 2. Optimoida Phactr4 proteiinin ja sen C- sekä N-terminaalisten fragmenttien tuoton lämpötila, aika sekä suorittaa liukoisuustesti kyseisille proteiineille sekä 3. Optimoida Phactr4 C- ja N-terminaalisten fragmenttien puhdistus.
Kloonauksen eri osia optimoitiin erilaisin tuloksin, mutta kloonaus saatiin suoritettua, kun käytetty vektori vaihdettiin toiseen erään pET41a vektoria. Paras lämpötila ja aika proteiinien tuottamiseen olivat +37oC ja kolme tuntia. Liukoisuustestin tulos kahden fragmenttien osalta oli, että molemmat proteiinit olivat liukoisia. Valitettavasti Phactr4 liukoisuustesti epäonnistui, koska proteiinia ei tuottunut, mutta sen kuitenkin oletetaan olevan myös liukoinen. Proteiinien puhdistuksen optimointi onnistui suhteellisen hyvin ja proteiineja saatiin puhdistettua vaihtelevalla menestyksellä. N-terminaalisen proteiinin tuotto ja puhdistus onnistui toista proteiinia paremmin ja puhdistuksilla saatiin pieni määrä kohtalaisen puhdasta proteiinia.
Kloonattua Phactr4 fragmenttia voidaan kokeilla tuottaa sopivissa bakteereissa sekä yrittää sen puhdistamista. Proteiinien tuotto onnistui hyvin, mutta sitä voidaan halutessa optimoida vielä lisää käyttäen pidempiä tuottoaikoja. Proteiinien puhdistus onnistui melko hyvin, mutta proteiinien puhdistusta on vielä optimoitava runsaasti lisää, jotta saataisiin suurempi määrä vielä puhtaampaa proteiinia talteen. Nyt saatua proteiinia tutkimusryhmä voi käyttää omissa tutkimuksissaan, joilla he pyrkivät selvittämään miten Phactr4 proteiini toimii.
Kloonauksen eri osia optimoitiin erilaisin tuloksin, mutta kloonaus saatiin suoritettua, kun käytetty vektori vaihdettiin toiseen erään pET41a vektoria. Paras lämpötila ja aika proteiinien tuottamiseen olivat +37oC ja kolme tuntia. Liukoisuustestin tulos kahden fragmenttien osalta oli, että molemmat proteiinit olivat liukoisia. Valitettavasti Phactr4 liukoisuustesti epäonnistui, koska proteiinia ei tuottunut, mutta sen kuitenkin oletetaan olevan myös liukoinen. Proteiinien puhdistuksen optimointi onnistui suhteellisen hyvin ja proteiineja saatiin puhdistettua vaihtelevalla menestyksellä. N-terminaalisen proteiinin tuotto ja puhdistus onnistui toista proteiinia paremmin ja puhdistuksilla saatiin pieni määrä kohtalaisen puhdasta proteiinia.
Kloonattua Phactr4 fragmenttia voidaan kokeilla tuottaa sopivissa bakteereissa sekä yrittää sen puhdistamista. Proteiinien tuotto onnistui hyvin, mutta sitä voidaan halutessa optimoida vielä lisää käyttäen pidempiä tuottoaikoja. Proteiinien puhdistus onnistui melko hyvin, mutta proteiinien puhdistusta on vielä optimoitava runsaasti lisää, jotta saataisiin suurempi määrä vielä puhtaampaa proteiinia talteen. Nyt saatua proteiinia tutkimusryhmä voi käyttää omissa tutkimuksissaan, joilla he pyrkivät selvittämään miten Phactr4 proteiini toimii.