Vasta-aineiden toimivuuden testaus Western blot -menetelmällä
Mahmoodi, Kochar (2012)
Mahmoodi, Kochar
Turun ammattikorkeakoulu
2012
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061512739
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2012061512739
Tiivistelmä
Opinnäytetyö tehtiin VTT:n lääkekehityksen biotekniikan Turun yksikössä. Työn päämääränä oli testata valmiiden seerumivasta-aineiden toimivuutta. Työssä testatut vasta-aineet tuotettiin osana Epitron EU-projektia.
VTT:n lääketieteellisen biotekniikan laboratoriossa aikaisemmin tehtyjen eturauhasen syöpään liittyvien tutkimuksien yhteydessä valittiin jatkotutkimuksiin 12 potentiaalista uutta lääkehoidonkohdetta ja merkkiainetta. Geenien toiminnan ja ilmentymisen tutkimiseksi eturauhassyöpäsoluissa sekä eturauhaskudoksessa tarvittiin kyseisten geenien proteiinituotteille toimivat vasta-aineet. Proteiineille tilattiin vasta-aineiden valmistus kaneissa Epitron EU-projektin avulla. Tässä opinnäytetyössä tutkittiin tuotettuja vasta-aineita sisältävien seeruminäytteiden toimivuutta antigeenin tunnistuksessa käyttäen Western-blot menetelmää.
Western- blot on menetelmä, jossa erilaiset molekyylit, tässä tapauksessa proteiinit, erotellaan ensin kokonsa mukaisesti sähkökentässä. Erotus tapahtuu SDS-PAGE (eng. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)-elektroforeesilla. Geelissä kokonsa mukaan ajautuneet proteiinit siirretään Transfer-ajossa sähkökentässä nitroselluloosakalvolle, jonka jälkeen voidaan kalvolla oleviin proteiineihin sitouttaa kullekin proteiinille spesifinen vasta-aine. Proteiinit ja niihin sitoutuneet vasta-aineet saadaan tämän jälkeen näkyviin HRP-leimatun (piparjuuriperoksidaasientsyymi engl. horseradish peroxidase) sekundaarisen vasta-aineen avulla, jolloin proteiinien ja niihin sitoutuneiden vasta-aineiden sijainti saadaan näkyviin röntgenfilmissä. Proteiinien visualisointiin käytettiin ECL Western blotting detection-reagenssia.
Osa työssä testatuista 22 vasta-aineita sisältävistä kanin seeruminäytteistä sitoutui epäspesifisesti muihin kuin kohdeproteiineihin ja osassa signaalia ei saatu näkymään. Kahdestatoista proteiinista neljälle löytyi mahdollisesti toimiva vasta-aine jatkotutkimuksia varten.
VTT:n lääketieteellisen biotekniikan laboratoriossa aikaisemmin tehtyjen eturauhasen syöpään liittyvien tutkimuksien yhteydessä valittiin jatkotutkimuksiin 12 potentiaalista uutta lääkehoidonkohdetta ja merkkiainetta. Geenien toiminnan ja ilmentymisen tutkimiseksi eturauhassyöpäsoluissa sekä eturauhaskudoksessa tarvittiin kyseisten geenien proteiinituotteille toimivat vasta-aineet. Proteiineille tilattiin vasta-aineiden valmistus kaneissa Epitron EU-projektin avulla. Tässä opinnäytetyössä tutkittiin tuotettuja vasta-aineita sisältävien seeruminäytteiden toimivuutta antigeenin tunnistuksessa käyttäen Western-blot menetelmää.
Western- blot on menetelmä, jossa erilaiset molekyylit, tässä tapauksessa proteiinit, erotellaan ensin kokonsa mukaisesti sähkökentässä. Erotus tapahtuu SDS-PAGE (eng. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)-elektroforeesilla. Geelissä kokonsa mukaan ajautuneet proteiinit siirretään Transfer-ajossa sähkökentässä nitroselluloosakalvolle, jonka jälkeen voidaan kalvolla oleviin proteiineihin sitouttaa kullekin proteiinille spesifinen vasta-aine. Proteiinit ja niihin sitoutuneet vasta-aineet saadaan tämän jälkeen näkyviin HRP-leimatun (piparjuuriperoksidaasientsyymi engl. horseradish peroxidase) sekundaarisen vasta-aineen avulla, jolloin proteiinien ja niihin sitoutuneiden vasta-aineiden sijainti saadaan näkyviin röntgenfilmissä. Proteiinien visualisointiin käytettiin ECL Western blotting detection-reagenssia.
Osa työssä testatuista 22 vasta-aineita sisältävistä kanin seeruminäytteistä sitoutui epäspesifisesti muihin kuin kohdeproteiineihin ja osassa signaalia ei saatu näkymään. Kahdestatoista proteiinista neljälle löytyi mahdollisesti toimiva vasta-aine jatkotutkimuksia varten.