Bakteerien kvantitointimenetelmän kehittäminen
Högmander, Milla (2013)
Högmander, Milla
Turun ammattikorkeakoulu
2013
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013060613397
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2013060613397
Tiivistelmä
Bakteerien kvantitointi on nykyään monessa yhteydessä tärkeää, kuten hygieniamäärityksissä ja lääkekehityksessä. Saatavilla on monia kaupallisia menetelmiä, joiden ominaisuudet vaihtelevat. Osa menetelmistä käyttää monimutkaista tai kallista teknologiaa. Toiset menetelmät ovat teknisesti yksinkertaisia, mutta ne voivat käsittää useampia työvaiheita ja viedä aikaa.
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää yksinkertainen, nopea ja edullinen menetelmä bakteerien kvantitoimiseen. Lisäksi tavoitteena oli, että menetelmällä voitaisiin havaita niin elävät kuin kuolleetkin solut.
Menetelmä perustuu fluoresenssin lähteenä käytettävän lantanidikelaatin epäspesifiseen vuorovaikutukseen bakteerien kanssa ja aikaerotteiseen luminesenssiin. Menetelmässä lantanidiin sitoutuneet ligandit viritetään ja siirtävät aktivaatioenergiaa lantanidille, jonka fluoresenssia mitataan. Bakteerien lukumäärän kasvu havaitaan signaalin muutoksena. Menetelmän optimoinnissa havainnoitiin erilaisten olosuhteiden vaikutusta signaaliin, sen stabiilisuuteen ja menetelmän herkkyyteen. Tutkittavia olosuhteita olivat muun muassa kelaatin koostumus ja sen pitoisuus, haihdutus, näytepuskurit sekä mediumpitoisuus.
Menetelmällä pystyttiin havaitsemaan Gram-negatiivisia ja -positiivisia bakteereita sekä eläviä ja kuolleita soluja. Menetelmän herkkyydeksi määritettiin 600 – 5 000 bakteeria, näytetilavuudesta riippuen. Menetelmän herkkyys ei riitä herkimpien kaupallisten kvantitointimenetelmien tasolle, mutta se soveltuu käytettäväksi esimerkiksi korvaamaan absorbanssimittaukset suurien bakteerimäärien seuraamiseen.
Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää yksinkertainen, nopea ja edullinen menetelmä bakteerien kvantitoimiseen. Lisäksi tavoitteena oli, että menetelmällä voitaisiin havaita niin elävät kuin kuolleetkin solut.
Menetelmä perustuu fluoresenssin lähteenä käytettävän lantanidikelaatin epäspesifiseen vuorovaikutukseen bakteerien kanssa ja aikaerotteiseen luminesenssiin. Menetelmässä lantanidiin sitoutuneet ligandit viritetään ja siirtävät aktivaatioenergiaa lantanidille, jonka fluoresenssia mitataan. Bakteerien lukumäärän kasvu havaitaan signaalin muutoksena. Menetelmän optimoinnissa havainnoitiin erilaisten olosuhteiden vaikutusta signaaliin, sen stabiilisuuteen ja menetelmän herkkyyteen. Tutkittavia olosuhteita olivat muun muassa kelaatin koostumus ja sen pitoisuus, haihdutus, näytepuskurit sekä mediumpitoisuus.
Menetelmällä pystyttiin havaitsemaan Gram-negatiivisia ja -positiivisia bakteereita sekä eläviä ja kuolleita soluja. Menetelmän herkkyydeksi määritettiin 600 – 5 000 bakteeria, näytetilavuudesta riippuen. Menetelmän herkkyys ei riitä herkimpien kaupallisten kvantitointimenetelmien tasolle, mutta se soveltuu käytettäväksi esimerkiksi korvaamaan absorbanssimittaukset suurien bakteerimäärien seuraamiseen.