DNA-koettimien suunnittelu järvisedimenttien mikrobien tunnistamiseksi LDR-siruilla
Halttunen, Atte (2010)
Halttunen, Atte
Lahden ammattikorkeakoulu
2010
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112916104
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-2010112916104
Tiivistelmä
Tämä opinnäyte oli osa YMLI-hanketta, jonka tavoitteena on mm. DNAsiruteknologian kehittäminen ympäristön mikrobien tunnistamiseksi. Opinnäytetyön tarkoituksena oli suunnitella lajitasoa edustavia koettimia sedimentin mikrobien seurantaan Ligation Detection Reaction (LDR) -sirulla. Opinnäytteessä käytetty sedimentti oli peräisin projektista, jossa tutkittiin rehevöityneiden järvien kunnostamista sedimenttiin levitettävällä happea vapauttavalla kemikaalilla. Koetinsuunnittelun tavoitteena oli ensisijaisesti suunnitella käsittelyä indikoivia koettimia ja toiseksi koettimia monimuotoisuuden seurantaan.
Koettimien suunnittelemiseksi sedimentistä eristettiin DNA, josta monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) osaa 16S rDNA:sta. Monistettujen 16S rDNA kappaleiden emäsjärjestys selvitettiin pyrosekvensoinnilla. Sekvensointiaineisto määritettiin OTU:iksi 97 %:n samankaltaisuusasteella, joka edustaa lajitasoa. Sedimentin mikrobiyhteisön selvittämiseksi sekvensointiaineistoa tarkasteltiin Ribosomal Data Base Projectin (RDP) Classifier- ja MEGAN-ohjelmalla. Näillä muodostettujen taksonomisesti hierarkkisten puiden avulla koetinsuunnitteluun valittiin 138 DNA-sekvenssiä, jotka edustivat OTU:ja.
Koettimia suunniteltiin yhteensä 87, joista 73 oli bakteereille ja 14 arkeille. Koettimista mahdollisesti 18 indikoi happikäsittelyn vaikutusta ja lopuilla seurattiin pelkästään monimuotoisuutta. Mikrobit olivat yleisesti ottaen tunnistettavissa heikosti, mihin vaikutti pyrosekvensoinnista saatujen DNA-sekvenssien lyhyys ja tutkittava ympäristö, sillä sedimentin mikrobistoa ei vielä tunneta kokonaisuudessaan kovinkaan hyvin. Tämän vuoksi pyrosekvensoinnilla tuotettua DNAsekvenssiaineistoa ei pystytty hyödyntämään kokonaisuudessaan koetinsuunnittelussa.
Koettimien suunnittelemiseksi sedimentistä eristettiin DNA, josta monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) osaa 16S rDNA:sta. Monistettujen 16S rDNA kappaleiden emäsjärjestys selvitettiin pyrosekvensoinnilla. Sekvensointiaineisto määritettiin OTU:iksi 97 %:n samankaltaisuusasteella, joka edustaa lajitasoa. Sedimentin mikrobiyhteisön selvittämiseksi sekvensointiaineistoa tarkasteltiin Ribosomal Data Base Projectin (RDP) Classifier- ja MEGAN-ohjelmalla. Näillä muodostettujen taksonomisesti hierarkkisten puiden avulla koetinsuunnitteluun valittiin 138 DNA-sekvenssiä, jotka edustivat OTU:ja.
Koettimia suunniteltiin yhteensä 87, joista 73 oli bakteereille ja 14 arkeille. Koettimista mahdollisesti 18 indikoi happikäsittelyn vaikutusta ja lopuilla seurattiin pelkästään monimuotoisuutta. Mikrobit olivat yleisesti ottaen tunnistettavissa heikosti, mihin vaikutti pyrosekvensoinnista saatujen DNA-sekvenssien lyhyys ja tutkittava ympäristö, sillä sedimentin mikrobistoa ei vielä tunneta kokonaisuudessaan kovinkaan hyvin. Tämän vuoksi pyrosekvensoinnilla tuotettua DNAsekvenssiaineistoa ei pystytty hyödyntämään kokonaisuudessaan koetinsuunnittelussa.