DNA-koettimien testaus ympäristösirua varten

Abstract

Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli testata 87 aiemmin suunnitellun DNA-koettimen toimivuus LDR (Ligation Detection Reaction) -sirulla. Koettimet oli suunnitellut Atte Halttunen järvisedimentin mikrobistolle. Opinnäytetyö oli osa Euroopan aluekehitysrahaston YMLI-hanketta (A30175), jonka yhtenä tavoitteena on kehittää nopeita analyysimenetelmiä ympäristön mikrobien tutkimiseen.

Koettimien toimivuus ja spesifisyys testattiin synteettisillä DNA-templaateilla. Tutkimuksessa käytettiin Biotekniikan Instituutissa (Helsingin yliopisto) sovellet-tua LDR-sirutekniikkaa, jossa DNA-koettimesta muodostuu sirkulaarinen sen yhdistyessä kohde-DNA:n kanssa. Sirkulaarisuutta käytetään hyödyksi monista-malla koetinta polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla, jolloin tekniikan herkkyys paranee. PCR-tuotteen tuloksia tarkasteltiin agaroosigeelielektroforeesilla ja hyb-ridisaatiolla LDR-sirulle.

Opinnäytetyössä testatuista koettimista arvioitiin erinomaisiksi 38 %, hyviksi 22 %, heikoiksi 18 %, epäspesifeiksi 8 % ja toimimattomiksi 14 %. Arviointi perustui koettimien antaman signaalin vahvuuteen ja spesifisyyteen LDR-sirulla. Kun koettimien suunnittelijan arviot koettimien hyvyydestä otettiin myös huomioon, saatiin erinoimaisesti toimivia koettimia 19 ja hyviä 29.

Testauksessa olosuhteiden optimointi oli työlästä ja muutamilla koettimilla toiste-tut rinnkkaistestit antoivat ristiriitaisia tuloksia. Toimivia koettimia saatiin huo-mattavasti vähemmän, kuin muiden samantyyppisten tutkimusten tulosten perus-teella olisi voitu ennakoida. Lisäksi koettimien spesifisyydessä olisi ollut paran-tamisen varaa, sillä seitsemän koetinta todettiin ”häiriköiksi”, jotka reagoivat vä-hintään kymmenen eri templaatin kanssa.

Tulevissa DNA-koetintestauksissa kannattaa käyttää jotakin kontrollikoetinta ja olosuhdetesteissä siruhybridisaatioita ja agaroosigeelielektroforeesia rinnakkain. Tässä työssä saatiin aikaiseksi yhdessä aiemman suunnittelutyön kanssa 48 käyt-tökelpoista koetinta ja kehitettyä ympäristösirua eteenpäin, vaikka työtä riittääkin vielä ennen kuin kaupallinen tuote on valmis.

The aim of this bachelor’s thesis was to test how DNA probes act on LDR chip. The intention was also to develop a suitable application to screen environmental samples efficiently. This bachelor’s thesis was part of the YMLI-project (A30175), which was funded by the EU’s regional development trust. 87 DNA probes were designed by Atte Halttunen in his bachelor’s thesis to identify the diversity of microbes in a lake sediment.

The function and spesificity of the probes were tested with synthetic DNA tem-plates. The LDR microarray method used in this study was applied by the Institute of Biotechnology in Finland. In this method, probes are circularized in the presence of applicable target DNA. A circular DNA probe is amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) to improve the sensitivity of this method. The readout of the PCR was examined with an agarosegelelectroforesis and with hybridization onto an LDR microarray.

Probes in this bachelor’s thesis were evaluated by the intensity of the signal and the spesifity of the probe. 38 % of the probes were evaluated as excellent, 22 % as good, 18 % as week, 8 % as unusable and 14 % nonfunctional. When the evalua-tion of the designer was also considered, there were 19 excellent and 29 good probes.

Optimizing the conditions of the ligation reaction and the PCR was effortful and a few tests with similar conditions and probes gave different results. From this contradiction the conclusion can be drawn that the method did not work as reliably as was hoped. There were much less workable probes than expected by the results of other similar studies. The spesifity of the probes could have been better considering those seven probes which were evaluated as unusable because they worked at least with ten wrong templates. In future testing of DNA probes it is worthwhile to use a reference probe to control the positive signal of the reaction. Also using agarosegelelectroforesis and hybridization on an LDR microarray simultaneously is recommendable when optimizing of conditions in the ligation reaction and the PCR.This study helped to develop the environmental microarray but there is still much to be done before it is commercialized.