Ravinteiden vaikutus poly-β-hydroksibutyraatin tuotantoon metanotrofien avulla

Abstract

Poly-β-hydroksibutyraatti on biopolymeeri, jota prokaryootit syntetisoivat hiili- ja energiavarastokseen epäsuotuisissa kasvuoloissa. Polymeeri muistuttaa ominaisuuksiltaan tavanomaisia petrokemian polymeereja. Metanotrofit ovat bakteereja, joita esiintyy kaikenlaisissa luonnon ekosysteemeissä. Ne hapettavat ympäristöissä syntyvää metaania ja vähentävät näin ilmakehään vapautuvan kaasun määrää. Bakteerit tuottavat poly-β-hydroksibutyraattia metaanista, kun niiden kasvualustasta puuttuu jokin ravinne.

Tämän opinnäytetyön tavoitteena oli selvittää, miten eri ravinteet vaikuttavat eksponentiaalisessa kasvunvaiheessa olevien metanotrofien metaaninhapetukseen ja poly-β-hydroksibutyraatin tuotantoon. Kasvualustan ravinteiden optimoinnin avulla voidaan tuottaa poly-β-hydroksibutyraattia metaanista muovien raaka-aineeksi in situ entistä tehokkaammin. Tarkoituksena oli kasvattaa kaatopaikkamaasta rikastettua metanotrofipopulaatiota eksponentiaaliseen kasvunvaiheeseen ja jatkaa kasvatusta mediumeissa, joista oli poistettu jokin ravinne. Tällöin bakteerit tuottavat poly-β-hydroksibutyraattia. Työ suoritettiin Tampereen teknillisellä yliopistolla Kemian ja biotekniikan laitoksella.

Rikastettua metanotrofipopulaatiota kasvatettiin metaani-ilmakaasufaasissa mediumeissa, joista oli poistettu sulfaatti, kalium, magnesium, nitraatti tai fosfaatti. Lisäksi tehtiin toinen nitraatiton kasvatussarja kaasufaasissa, jossa typen määrää rajoitettiin. Syntyneen polymeerin määrä mitattiin inkuboinnin päätyttyä kylmäkuivatusta biomassasta kaasukromatografisesti. Kokeet tehtiin suljettuina pullokasvatuksina. Nitraatiton medium oli poly-β-hydroksibutyraatin saannon kannalta selvästi paras. Kaasufaasin typen rajoittaminen ei tehostanut biopolymeerin tuottoa eikä metaaninhapetusta. Metaaninhapetuksessa ei ollut merkittäviä eroja ravinteikkaan, magnesiumittoman, kaliumittoman, fosfaatittoman ja sulfaatittoman kasvatusalustan välillä. Nitraatittomissa mediumeissa metanotrofit hapettivat metaania selvästi muita kasvatuksia vähemmän.

Saadut tulokset tukevat aiemmin tehtyjä tutkimuksia nitraatittomien kasvatusmediumien osalta. Joissakin tutkimuksissa on saatu poikkeavia tuloksia muita ravinteita käytettäessä. Tässä työssä saatiin selvitettyä, että tutkitun kaatopaikkamaan metanotrofien poly-β-hydroksibutyraatin tuotannolle optimaalisinta on poistaa kasvatusalustasta nitraatti. Lisätutkimuksia tarvitaan metanotrofipopulaation lajien selvittämisessä ja kaasufaasin typen vaikutusten tarkentamisessa.

Poly-β-hydroxybutyrate is a biopolymer that prokaryotes synthesize for carbon and energy reserve in unfavorable growth conditions. The attributes of the polymer resemble traditional petrochemical polymers’ features. Methanotrophic bacteria are found in all kinds of natural ecosystems. They oxidize methane originating from environments and therefore reduce the amount of gas released to the atmosphere. Bacteria produce poly-β-hydroxybutyrate from methane when the amount of nutrient is limited in their growth medium.

The objective of this thesis was to examine the effects of limiting nutrients on the methane oxidizing potential and production of poly-β-hydroxybutyrate in exponential phase methanotrophic bacteria. By optimizing the nutrients in the growth medium, the production of poly-β-hydroxybutyrate from methane to plastic raw material in situ can be enhanced. The purpose was to cultivate methanotrophic bacteria enriched from landfill soil to exponential growth phase and continue culturing them in nutrient-free medium. Under these conditions bacteria produce poly-β-hydroxybutyrate. The study was performed at the department of Chemistry and Biotechnology of the Tampere University of Technology.

The enriched methanotrophic bacteria population was cultivated in a gas phase containing methane and air, in a medium that lacked sulfate, potassium, magnesium, nitrate or phosphate. Another culturing was carried out in a nitrate-free medium within a nitrogen-limited gas phase. The amount of polymer produced was determined after incubation from lyophilized biomass by gas chromatography. The experiments were performed as batch cultures. The nitrate-free medium was the best option considering the poly-β-hydroxybutyrate yield. No significant differences were observed in the bacteria methane oxidizing potential when comparing the nutrient-rich, magnesium-free, potassium-free, phosphate-free and sulfate-free medium. The methanotrophic bacteria oxidized methane distinctly less in nitrate-free medium.

The accomplished results are in accordance with previous studies performed with nitrate-free medium. Other studies have resulted in different outcomes through the use of the other nutrients. In this thesis it was indicated the methanotrophic bacteria in the soil of this particular landfill produce poly-β-hydroxybutyrate most efficiently when using nitrate-free medium. Further experiments are required to specify the species in the methanotrophic bacteria population and to define the effects of molecular nitrogen exposure.