Antigeenin kalvorakkulakuljetus B-soluissa

Abstract

B-solut ovat tärkeä osa adaptiivista immuniteettia. Ne vastaavat elimistön vasta-aineiden tuotannosta, joiden avulla elimistö pystyy taistelemaan tehokkaasti infektioita vastaan. Erilaistuakseen vasta-aineita tuottaviksi plasmasoluiksi B-solujen täytyy ottaa tunnistamansa antigeeni sisäänsä, pilkkoa se ja esitellä se eteenpäin T-soluille. Antigeenin prosessointiketju B-soluissa tunnetaan vielä erittäin huonosti. Tässä tutkimuksessa antigeenin prosessointiin liittyvät rakenteet on selvitetty aikajanallisesti, eikä tämän tyyppistä tutkimusta tiettävästi ole aiemmin tehty.

Opinnäytetyön tavoitteena oli tutkia antigeeniä pilkkovaa solunsisäistä reittiä EEA1-proteiinin, LAMP1-proteiinin ja Rab-proteiinien avulla. EEA1-proteiini toimii varhaisten endosomien merkkiaineena kun taas LAMP1-proteiini esiintyy myöhäisissä endosomeissa sekä lysosomeissa. Myös Rab-proteiinit toimivat eri soluelinten merkkiaineina. Ne ovat pieniä GTPaaseja, jotka koordinoivat solunsisäistä kalvorakkulakuljetusta.

Tutkimuksessa selvitettiin endogeenisten Rab-proteiinien, EEA1-proteiinin ja LAMP1-proteiinin sijainti B-soluissa sekä niiden keskinäinen vuorovaikutus eri aktivointiaikojen kuluttua. In vitro viljellyt B-solut aktivoitiin liukoisella antigeenillä. Aktivoidut solut immunovärjättiin ensin primaarivasta-aineilla ja sitten fluoresoivilla sekundaarivasta-aineilla. Solujen kuvaus tehtiin spinning disk -konfokaalimikroskoopilla (SDCM). Tutkittaessa LAMP1-proteiinia visuaalisen tarkastelun lisäksi näistä soluista tehtiin myös korrelaatioanalyysit. Lisäksi tutkittiin, miltä Rab5/7/9/11- ja EEA1-proteiinit näyttävät aktivoimattomissa B-soluissa.

Antigeenin prosessointiketjuun osallistuvat keskenään vuorovaikutuksessa olevat Rab-proteiinit ja EEA1- sekä LAMP1-proteiinit. Opinnäytetyössä on havainnollistettu antigeenin prosessointiketju korrelaatiokuvaajien ja SDCM-kuvien avulla. Tutkimuksessa määritellään myös Rab-proteiinien käyttäytyminen aktivoimattomissa B-soluissa. Aktivoimattomia B-soluja tutkittaessa huomattiin, että Rab5/7/9 kerääntyvät niin sanottuun rakkulakeskittymään. Huomattiin myös, että EEA1 ei keräänny Rab-proteiinien tavoin aktivoimattomissa B-soluissa, mutta aktivoinnin jälkeen myös EEA1 kerääntyy rakkulakeskittymään. Rab-proteiineilla havaittiin olevan lisäksi muita rooleja, jotka poikkeavat yleisestä näkemyksestä: esimerkiksi Rab5:n ja EEA1:n rinnakkainen lokalisaatio (ei päällekkäinen) sekä Rab9 ja antigeenin korrelaatio 10 minuutin aikapisteessä.

B cells are an important part of the adaptive immune system. They produce antibodies which help the system to efficiently fight against infections. In order to differentiate into antibody producing plasma cells, B cells must internalize the antigen, process it and present it as peptides for T cells. Antigen processing in B cell is not well understood. In this study, the vesicular structures involved in the antigen processing are reported spatiotemporally. To our knowledge, this study is the first of its kind.

The aim of this thesis was to study the intracellular antigen processing pathway using EEA1, LAMP1 and Rab proteins. EEA1 is associated with early endosomes while LAMP1 protein is associated with late endosomes and lysosomes. Also the Rab proteins are associated with different vesicular compartments. Rab proteins are small GTPases controlling intracellular trafficking in many cell types.

In this study, the localization of endogenous Rab proteins, EEA1 and LAMP1 and their interactions were studied at different time points after antigen addition. In vitro cultured B cells were activated with antigen in solution. Activated cells were immunostained first with primary antibodies and then with fluorescent secondary antibodies. The cells were imaged with a spinning disc confocal microscope (SDCM). In addition to visual evaluation, correlation analysis was performed for LAMP1-Rab -studies. Rab5/7/9/11 and EEA1 proteins were also examined for their localization and expression levels in inactivated B cells.

Rab proteins, EEA1 and LAMP1 are involved in the antigen processing pathway in interaction with each other. In this thesis, the antigen processing pathway, marked by these proteins, is illustrated with correlation plots and SDCM images. In addition, the localization of Rab proteins was determined in inactivated B cells. Rab5/7/9 were found to cluster in a central cluster in inactivated cells. In addition, EEA1 did not seem to have a similar role but it clustered in the central cluster after B cell activation. It was established that Rab proteins in B cells also have different roles from those reported for other cell types. For example Rab5-EEA1 possesses parallel localization (not colocalization) and Rab9 and antigen were correlating already at the 10 minute time point.