Solunsisäisen GTP-konsentraation määrittäminen

Abstract

Guanosiinitrifosfaatti on yksi solujen keskeisistä energiamolekyyleistä. Sillä on tärkeä rooli solun toimintojen säätelyssä esimerkiksi G-proteiinien aktivoinnissa ja signaalien välityksessä. GTP on elintärkeää soluille ja solun GTP-konsentraation muutosten ymmärtäminen auttaisi uusien terapeuttisten menetelmien kehittämisessä.

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää menetelmää solunsisäisen GTP-konsentraation määrittämiseen. Menetelmä pohjautuu GTP-molekyylin tunnistavaan vasta-aineeseen, jonka sitoutumista mitattiin QRET-menetelmällä. Tavoitteena oli optimoida määrityksen mittausolosuhteet, testata vasta-aineen sitoutumisspesifisyyttä ja kokeilla määrityksen toimivuutta solu-uutteella.

Opinnäytetyössä tuotettiin 2A4GTP-vasta-ainetta Escherichia coli -bakteereissa fermentoimalla ja vasta-aineen spesifisyys GTP:lle testattiin GTP- ja GDP-titrauksilla. GTP-konsentraatio-määrityksen olosuhteet optimoitiin vasta-aineelle ja muille tarvittaville reagensseille ja määritystä testattiin solu-uutteella. Lisäksi työn aikana testattiin alkuperäisen 2A4GTP-vasta-aineen pohjalta luotuja uusia vasta-aineita, joiden avulla määritystä pyrittiin parantamaan.

Määritykset osoittivat, että solu-uutteen häiritsevien komponenttien vuoksi solujen GTP-konsentraatiota ei pystytty havaitsemaan alkuperäisellä vasta-aineella. Sitoutumisominaisuuksiltaan muunnellut vasta-aineet osoittivat korkeaa sitoutumista GTP-molekyyliin heterogeenisessä määrityksessä. Kuitenkin erotusvapaassa määrityksessä havaittiin, että uudet vasta-aineet osoittivat eri suolaherkkyyttä kuin alkuperäinen, eikä niitä siksi voida suoraan käyttää erotusvapaassa määrityksessä ilman määritysolosuhteiden uudelleen optimointia.

Guanosine triphosphate is one of the main energy sources of the cell. GTP has an important role in controlling cell functions, for example activating G proteins and transmitting signals. GTP is essential for the cell, and understanding the changes in GTP concentration might help in developing new therapeutic methods.

The aim of this thesis was to develop a method for measuring the intracellular GTP concentration. The method is based on a GTP-binding antibody, and the binding was detected using QRET measurement. The aim was to optimize the measurement conditions of the assay, to test the binding specificity of the antibody and to determine whether the assay works with cell lysate.

2A4GTP antibody was produced in Escherichia coli bacteria by fermentation. The specificity of the antibody to GTP was tested by GTP and GDP titration. The conditions of the GTP concentration assay were optimized, and the assay was tested with cell lysate. Antibodies modified from the original 2A4GTP antibody were also tested to see if they would make the assay more specific.

The results showed that due to the disturbing components of the cell lysate, the GTP concentration of the cell was not detected with the original antibody. The modified antibodies seemed to bind firmly to the GTP molecule in the heterogeneous assay, whereas in the homogeneous assay the modified antibodies showed differences in salt response compared to the original antibody. Thus, the modified antibodies can not be used in the homogeneous assay before re-optimization.