Solunsisäisen GTP-konsentraation määrittäminen
Vuorinen, Iida (2016)
Vuorinen, Iida
Turun ammattikorkeakoulu
2016
All rights reserved
Julkaisun pysyvä osoite on
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605239379
https://urn.fi/URN:NBN:fi:amk-201605239379
Tiivistelmä
Guanosiinitrifosfaatti on yksi solujen keskeisistä energiamolekyyleistä. Sillä on tärkeä rooli solun toimintojen säätelyssä esimerkiksi G-proteiinien aktivoinnissa ja signaalien välityksessä. GTP on elintärkeää soluille ja solun GTP-konsentraation muutosten ymmärtäminen auttaisi uusien terapeuttisten menetelmien kehittämisessä.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää menetelmää solunsisäisen GTP-konsentraation määrittämiseen. Menetelmä pohjautuu GTP-molekyylin tunnistavaan vasta-aineeseen, jonka sitoutumista mitattiin QRET-menetelmällä. Tavoitteena oli optimoida määrityksen mittausolosuhteet, testata vasta-aineen sitoutumisspesifisyyttä ja kokeilla määrityksen toimivuutta solu-uutteella.
Opinnäytetyössä tuotettiin 2A4GTP-vasta-ainetta Escherichia coli -bakteereissa fermentoimalla ja vasta-aineen spesifisyys GTP:lle testattiin GTP- ja GDP-titrauksilla. GTP-konsentraatio-määrityksen olosuhteet optimoitiin vasta-aineelle ja muille tarvittaville reagensseille ja määritystä testattiin solu-uutteella. Lisäksi työn aikana testattiin alkuperäisen 2A4GTP-vasta-aineen pohjalta luotuja uusia vasta-aineita, joiden avulla määritystä pyrittiin parantamaan.
Määritykset osoittivat, että solu-uutteen häiritsevien komponenttien vuoksi solujen GTP-konsentraatiota ei pystytty havaitsemaan alkuperäisellä vasta-aineella. Sitoutumisominaisuuksiltaan muunnellut vasta-aineet osoittivat korkeaa sitoutumista GTP-molekyyliin heterogeenisessä määrityksessä. Kuitenkin erotusvapaassa määrityksessä havaittiin, että uudet vasta-aineet osoittivat eri suolaherkkyyttä kuin alkuperäinen, eikä niitä siksi voida suoraan käyttää erotusvapaassa määrityksessä ilman määritysolosuhteiden uudelleen optimointia.
Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää menetelmää solunsisäisen GTP-konsentraation määrittämiseen. Menetelmä pohjautuu GTP-molekyylin tunnistavaan vasta-aineeseen, jonka sitoutumista mitattiin QRET-menetelmällä. Tavoitteena oli optimoida määrityksen mittausolosuhteet, testata vasta-aineen sitoutumisspesifisyyttä ja kokeilla määrityksen toimivuutta solu-uutteella.
Opinnäytetyössä tuotettiin 2A4GTP-vasta-ainetta Escherichia coli -bakteereissa fermentoimalla ja vasta-aineen spesifisyys GTP:lle testattiin GTP- ja GDP-titrauksilla. GTP-konsentraatio-määrityksen olosuhteet optimoitiin vasta-aineelle ja muille tarvittaville reagensseille ja määritystä testattiin solu-uutteella. Lisäksi työn aikana testattiin alkuperäisen 2A4GTP-vasta-aineen pohjalta luotuja uusia vasta-aineita, joiden avulla määritystä pyrittiin parantamaan.
Määritykset osoittivat, että solu-uutteen häiritsevien komponenttien vuoksi solujen GTP-konsentraatiota ei pystytty havaitsemaan alkuperäisellä vasta-aineella. Sitoutumisominaisuuksiltaan muunnellut vasta-aineet osoittivat korkeaa sitoutumista GTP-molekyyliin heterogeenisessä määrityksessä. Kuitenkin erotusvapaassa määrityksessä havaittiin, että uudet vasta-aineet osoittivat eri suolaherkkyyttä kuin alkuperäinen, eikä niitä siksi voida suoraan käyttää erotusvapaassa määrityksessä ilman määritysolosuhteiden uudelleen optimointia.