Pikornavirusvasta-aineiden testaaminen immunofluoresenssimikroskopiaa käyttäen

Abstract

Opinnäytetyön aiheena oli testata erilaisten vasta-aineiden kykyä tunnistaa pikornaviruksia käyttäen immunofluoresenssimenetelmää (IFA). Työ tehtiin Turun yliopistossa, Virusopilla AIROPico-projektissa. Pikornavirukset ovat pieniä, vaipattomia RNA-viruksia, jotka aiheuttavat ihmiselle monia erilaisia tauteja, kuten flunssaa ja aseptista aivokalvontulehdusta. Työssä käytettiin pääasiassa pikornavirus-perheeseen kuuluvia rinoviruksia.

Työ sisälsi soluviljelyä, virus-RNA:n puhdistusta, RT-qPCR-tekniikan käyttöä, virusinfektiota, solujen fiksausta, vasta-ainevärjäystä sekä mikroskopointia. RT-qPCR-menetelmää käytettiin varmentamaan viruksien lisääntymiskyky. Vasta-aineiden testaus suoritettiin infektoimalla ja fiksaamalla HeLa-E8-soluja 96-kuoppalevyllä, värjäämällä ne vasta-aineilla ja tarkastelemalla tuloksia fluoresenssimikroskoopilla. Värjätyt solut kuvannettiin. RT-qPCR:n ja IFA:n tuloksia verrattiin toisiinsa.

Kahdeksan vasta-ainetta testattiin 20 pikornavirustyyppiä vastaan. Eniten viruksia tunnistivat monoklonaaliset vasta-aineet MAb C01698M (7 kpl) ja C01696M (6 kpl). MAb C01698M tunnisti rinovirustyypit A2, A10, A39, A49, A80, B91 ja kliinisen näytteen #592. MAb C01696M tunnisti rinovirustyypit A2, A10, B14, A39, A49 ja A80. MAb HRV-16-7 ei tunnistanut yhtään virusta. Loput käytetyistä vasta-aineista tunnistivat 1-4 virusta. Epävarmoja tuloksia oli paljon suuren taustan vuoksi.

The objective of the thesis was to test the ability of different antibodies to identify picornaviruses by immunofluorescence assay (IFA). The experiments were performed as part of the AIROPico project at the Department of Virology, University of Turku. Picornaviruses are small RNA viruses that do not have a membrane. They inflict various diseases on humans, such as flu and aseptic meningitis. Rhinoviruses that belong to the family Picornaviridae were mostly used in this experiment.

The experiment included culturing cells, purifying viral RNA, using the RT-qPCR technique, infecting cells with viruses, cell fixing, antibody dying, and microscopy. RT-qPCR was used to confirm the fertility of the viruses. Antibody testing was performed by infecting and fixing HeLa-E8 cells in a 96-well plate, dying them with antibodies and inspecting the results with a fluorescence microscope. The dyed cells were imaged. The RT-qPCR and IFA results were compared.

Altogether 8 antibodies were tested against 20 viruses. The best results were obtained with monoclonal antibodies MAb C01698M (7 pcs) and C01696M (6 pcs). MAb C01698M identified rhinovirus types A2, A10, A39, A49, A80, B91 and a clinical sample #592. MAb C01696M identified rhinovirus types A2, A10, B14, A39, A49 and A80. MAb HRV-16-7 did not identify any viruses. The rest of the used antibodies identified 1 to 4 viruses. There were a vast number of uncertain results because of the background.